caracteristicile clinice și structurale ale vacuolelor capului spermei la bărbații incluși în programul de fertilizare in Vitro

rezumat

vacuolele capului spermei umane și rolul lor în infertilitatea masculină sunt încă puțin înțelese. Scopul acestui studiu a fost de a identifica caracteristicile clinice și ultrastructurale ale vacuolelor capului spermei umane la bărbații incluși în programul de fertilizare in vitro: bărbați cu morfologie normală (normozoospermie) și morfologie a spermei afectată (teratozoospermie). Probele de spermă au fost observate la o mărire de 6000 de ori utilizând examenul morfologic al organelor spermatozoizilor motili (MSOME). Proporția spermei cu vacuole de cap a fost evaluată și legată de rezultatul fertilizării in vitro. Sperma bărbaților cu morfologie spermatozoidă afectată a fost caracterizată de o proporție mai mare de vacuole ale capului spermatozoizilor. Vacuolele capului spermei au fost legate de calitatea spermei afectată (concentrația, motilitatea și morfologia spermei), dar nu au fost influențate de factorii masculi (volumul spermei, înălțimea, vârsta, greutatea sau indicele de masă corporală). Mai mult, vacuolele capului spermei au fost legate de rata de fertilizare afectată doar după fertilizarea clasică in vitro (FIV), în timp ce nu a existat nicio legătură cu sarcina. Într-un subgrup de bărbați, sperma a fost fixată și observată prin microscopie electronică de transmisie (TEM). Studiul ultrastructural a arătat că vacuolele capului spermei sunt indentări nucleare mari de diferite dimensiuni și poziții, ambalate cu material membranos organizat în vârtejuri de membrană (MW).

1. Introducere

infertilitatea masculină poate fi legată de morfologia anormală a spermatozoizilor. În ultimii ani, au existat multe dezbateri cu privire la un nou parametru potențial al calității spermei și al fertilității masculine, vacuolele capului spermei. În ciuda acestui fapt, vacuolele capului spermei umane și rolul lor potențial în infertilitatea masculină sunt încă puțin înțelese.

folosind examinarea morfologică a organelor spermatozoizilor motili (MSOME), unde celulele spermatice vii sunt vizualizate cu microscopie DIC Nomarski la mărire de 6000 de ori, sunt vizibile unele structuri morfologice fine care ar putea fi utile pentru a determina calitatea spermei. Această metodă prezintă concavități de suprafață mici și mai mari denumite vacuole de spermă, situate de obicei în capul celulelor spermei. Natura și originea vacuolelor capului spermei sunt încă incerte și nu este clar dacă provin din nucleu sau acrosom sau alte structuri membranoase. Vacuolele se găsesc, de asemenea, în aproape toate probele cu morfologie normală a spermei (>14% spermatozoizi morfologic normali conform criteriilor stricte ale lui Kruger) și sunt localizate în principal la vârful sau zona mijlocie a capetelor spermei . Imaginile tridimensionale de deconvoluție, care detectează ADN-ul, au arătat vacuole ca „concavități nucleare”, iar microscopia Forței Atomice a dezvăluit membrana plasmatică intactă, dar ușor scufundată în zona vacuolelor . Mai mult, imaginile microscopului electronic ale probelor de spermă la pacienții cu morfologie anormală a spermei, teratozoospermie (<14% spermatozoizi normali în probă conform criteriilor stricte ale lui Kruger), au arătat vacuole exclusiv în zona nucleului spermei . Locația anterioară a vacuolelor capului spermei a dus la întrebarea despre posibila lor origine din acrosom. Inducerea reacției acrosome de către ionoforul a23587, lichidul folicular și acidul hialuronic a scăzut procentul de spermatozoizi cu vacuole de cap, ceea ce a sugerat că acestea ar putea fi legate de acrosom. Cu toate acestea, vacuolele sunt prezente și în probele de spermă fără acrosom (adică globozoospermie), sugerând că acestea nu provin din acrosom . S-a demonstrat că probele cu vacuole mari ale capului de spermă (mai mult de 13% din suprafața capului) au un procent mai mare de ADN fragmentat comparativ cu cele cu vacuole mici, precum și o frecvență mai mare a anomaliilor cromozomiale . Vacuolele capului spermei observate sub mărirea mare a microscopiei luminoase au fost descrise ca concavități nucleare „de buzunar” legate de eșecul condensării cromatinei . Dimpotrivă, unii cercetători nu au găsit nicio corelație între vacuolele mari ale capului spermei și deteriorarea ADN-ului sau anomaliile cromozomiale . Modelarea nucleului spermatozoizilor în timpul spermiogenezei implică nucleoproteine, manchetă microtubulară și material perinuclear despre care se știe că participă la ancorarea acrosomă a nucleului și constituie, de asemenea, Teca perinucleară . În timpul spermiogenezei, nucleul devine izbitor de redus, iar nucleozomii apar de obicei Distribuiți non-aleatoriu în întregul genom. ADN-ul legat de nucleozomi poate rămâne asamblat cu matricea nucleară și este văzut ca „spațiu gol” în imaginile electronice. Împreună ar putea avea un rol important în structura cromatinei paterne în urma fertilizării . În etapele târzii ale spermiogenezei, ADN-ul nuclear devine foarte condensat, deoarece histonele nucleoproteinelor sunt înlocuite cu protamine . În timpul înlocuirii nucleoproteinelor, multe proteine funcționale temporar sunt formate și degradate în locuri speciale de degradare. Buzunarele nucleare de la baza capului spermei au fost propuse să funcționeze ca centre proteolitice și locul de ieșire de unde reziduurile de proteine părăsesc nucleul și pot fi conectate funcțional cu vacuole .

vacuolele capului spermatozoizilor sunt un parametru interesant, dar puțin înțeles, al calității spermei și al fertilității masculine, care par a fi legate de rezultatul fertilizării in vitro la bărbații cu calitatea spermei afectată . Originea și dinamica vacuolelor capului spermei nu sunt bine înțelese, iar rolul lor în funcția spermei este discutabil. Unii autori sugerează că vacuolele spermei sunt trăsături normale ale capului spermei , în timp ce alții le descriu ca structuri degenerative legate de subfertilitatea masculină . Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a evalua procentele de spermă cu vacuole de cap atât în probele normale de spermă, cât și în probele cu morfologie spermatozoidă afectată și de a le raporta la rezultatul fertilizării in vitro. Mai mult, ultrastructura și funcția vacuolelor capului spermei au fost reconsiderate în raport cu maturarea spermei, folosind rezoluția înaltă a microscopiei electronice de transmisie.

2. Materiale și metode

în acest studiu au fost examinate probele de spermă a 81 de bărbați incluși în programul de fertilizare in vitro: 40 de bărbați cu morfologie normală a spermei și 41 de bărbați cu morfologie anormală a spermei (teratozoospermie) conform criteriilor stricte ale lui Kruger (anormal: < 14% spermă normală). Probele de spermă au fost preparate și utilizate pentru fertilizarea in vitro. Fiecare probă de spermă a fost preparată prin centrifugare (300 g) timp de 20 min pe un gradient de Densitate 100%/40% de PureSperm (Nidacon, Suedia) urmată de tehnica swim-up, unde cele mai bune spermatozoizi au fost extrase din probă. Toate probele normale de spermă au fost utilizate pentru fertilizarea clasică in vitro (FIV), în timp ce probele cu morfologie anormală a spermei au fost utilizate pentru injectarea intracitoplasmatică a spermei (ICSI) pentru fertilizarea ovocitelor partenerului feminin. Probele, care au rămas după fertilizarea in vitro, au fost utilizate pentru examinarea morfologică a organelor spermatozoizilor motili (MSOME) pentru a evalua procentul de vacuole ale capului spermatozoizilor din fiecare probă sub o mărire de 6000 de ori. Procentele de spermă cu vacuole cap și rezultatul fertilizării in vitro au fost comparate între probele de spermă normale și anormale. Folosind rezoluția înaltă a microscopiei electronice de transmisie (TEM), s-a observat ultrastructura a 10 probe de bărbați normozoospermici și 6 probe de bărbați teratozoospermici. Funcția potențială și structura vacuolelor au fost căutate, de asemenea, în raport cu procesul de maturare a spermei.

această cercetare a fost aprobată de Comitetul Național de etică medicală.

2.1. Parametrii clasici ai calității materialului seminal

au fost evaluați parametrii clasici, concentrația și motilitatea spermei și morfologia fiecărui eșantion de spermă. Proba de spermă trebuia să fie normală la concentrația de 15 milioane de spermatozoizi pe mL și 40% din totalul spermatozoizilor motili (progresivi și neprogresivi) conform criteriilor OMS și la 14% din spermatozoizii morfologic normali conform criteriilor stricte ale lui Kruger.

2.2. Examinarea morfologică a organelor spermatozoizilor motili(MSOME)

pentru examinarea morfologică a organelor spermatozoizilor motili, am folosit picături de mediu SpermSlow (Origio, Danemarca) într-un vas cu fund de sticlă (GWSt1000; Will Co, Wells, Amsterdam, Olanda) și picături de probă de spermă preparate prin tehnica swim-up, descrisă anterior de Knez . Spermatozoizii din fiecare probă au fost monitorizați sub un microscop inversat cu o etapă încălzită echipată cu contrast de interferență diferențială (Eclipse TE2000-s; Nikon, Japonia). O picătură subțire, alungită de Spermămediu lent (Origio, Danemarca) a fost plasat pe fundul unui vas de sticlă. O picătură mai mică de spermatozoizi pregătiți a fost plasată lângă Spermăpicătura scăzută și spermatozoizii legați de hialuronat. Toate picăturile au fost acoperite cu ulei de parafină pentru a preveni uscarea probei de spermă. Pentru observarea sub 6000 mărire, o picătură de ulei de imersie a fost introdusă sub vasul de sticlă (sub picăturile SpermSlow). O picătură de SpermSlow cu spermatozoizi legați a fost monitorizată de obiectivul de imersiune, contrastul interferenței diferențiale și o cameră digitală Nikon DS-Ri1. În fiecare probă, 200 de spermatozoizi legați de hialuronat au fost aleși și evaluați în funcție de vacuolele capului, la o mărire de 6000 de ori. Sistemul de notare pentru evaluarea fiecărui spermatozoid sa bazat pe următoarea clasificare a Vanderzwalmen . În funcție de numărul de vacuole și dimensiunea lor, spermatozoizii au fost clasificați în următoarele: clasa I: absența vacuolelor, Clasa II: maximum două vacuole mici, clasa III: mai mult de două vacuole mici sau cel puțin un vacuol mare și clasa IV: vacuole mari în combinație cu forme anormale ale capului sau alte anomalii. În fiecare probă de spermă, au fost evaluate proporțiile spermatozoizilor din clasa I, Clasa II, clasa III și clasa IV. Pentru statistici, proporțiile spermatozoizilor din clasa I și clasa II au fost combinate într-un singur grup, „spermă bună”, iar proporțiile spermei din clasa III și clasa IV într-un singur grup, „spermă proastă”, în 3 Termeni de vacuole ale capului spermei.

2.3. Microscopie electronică de transmisie(TEM)

pentru a descrie caracteristicile ultrastructurale ale vacuolelor din nucleul spermei, probele de spermă alese au fost centrifugate la 500 g timp de 10 minute la temperatura camerei. Supernatanții au fost îndepărtați cu grijă și peletele au fost fixate în 2,5% glutaraldehidă și 1% paraformaldehidă în 0.1 M PB (tampon fosfat s Oqustrensen lui), pH 7.0 pentru 24 h la 4 centi c, postfixed cu 1% OsO4 în 0.1 m PB pentru 1.5 h, și încorporat în rășină Agar 100 (agar științific). Secțiunile Ultrathin au fost colorate cu soluție de apă 4% de acetat de uranil și citrat de plumb Reynolds. Probele au fost examinate cu microscopul electronic Philips CM 100 (Fei, Olanda), funcționând la 80 kV; imaginile au fost înregistrate cu camera Bioscan 792 și Orius 200 (Gatan) folosind Micrograf Digital, software (Gatan Inc., Washington, DC, SUA) la măriri de la 1100 la 92000 de ori.

2.4. Analiza statistică

semnificația statistică a diferențelor în procentele de spermatozoizi cu vacuole cap de spermatozoizi și rezultatul fertilizării in vitro (rata de sarcină) între probele normale de spermă și probele cu morfologie anormală (teratozoospermie) au fost evaluate prin testul chi-pătrat. Procentele de spermă” bună „(clasa I și clasa II),” spermă proastă ” (clasa III și clasa IV) și clasa I, Clasa II, clasa III și clasa IV în ceea ce privește vacuolele capului spermei au fost corelate cu parametrii clasici ai calității spermei (concentrație, motilitate și morfologie), factori masculi (volumul spermei, leucocitospermia, vârsta, înălțimea, greutatea și indicele de masă corporală) și rezultatul fertilizării in vitro (fertilizare, blastocist și rate de sarcină) folosind corelația rho a lui Spearman. Pentru rezultatul fertilizării in vitro, datele au fost evaluate pentru ciclurile totale de fertilizare in vitro și separat pentru fertilizarea in vitro clasică (FIV) și injectarea intracitoplasmatică a spermei (ICSI). Dependența sarcinii de factorii feminini și masculi (inclusiv vacuolele capului spermatozoizilor) a fost evaluată prin regresie logistică multivariată. Semnificația statistică a fost stabilită la .

3. Rezultate și discuții

3.1. Examinarea morfologică a organelor spermatozoizilor motili (MSOME)

3.1.1. Vacuole de cap de spermă așa cum se vede prin microscopia cu lumină a MSOME

în ambele probe de spermă normale și anormale, vacuolele au fost localizate în diferite părți ale capului spermatozoizilor. Au fost văzute ca concavități de suprafață sau zone translucide mai ușoare de diferite dimensiuni și numere. În literatură, vacuolele capului spermei sunt descrise ca concavități de suprafață , concavități nucleare asemănătoare buzunarului sau amprente nucleare sub microscopul luminos. În studiul nostru, MSOME, folosind microscopia DIC Nomarski la o mărire de 6000 de ori, a arătat vacuolele capului spermei ca concavități de suprafață (Figura 1). Cu toate acestea, trebuie să luăm în considerare faptul că microscopia DIC Nomarski are ca rezultat o imagine pseudo-3D datorită refracției luminii care trece prin specimenul de diferite grosimi și densități optice. Prin urmare, este posibil ca regiunile nucleare cu densitate optică diferită să nu fie doar concavități, ci și bulgări neregulate la suprafața celulei.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figura 1

sperma cu vacuole de cap în probele normozoospermice ((A), (c) și (e)) și teratozoospermice ((b), (d) și (f) observate cu microscopie DIC (Nomarski) la mărire de 6000 de ori.

3.1.2. Vacuolele capului spermei, parametrii clasici ai calității spermei și factorii masculi

datele noastre arată că vacuolele capului spermei au fost prezente atât în probele normale, cât și în cele anormale (Figura 1). Interesant, a existat o proporție relativ mare (74,6%) de spermatozoizi cu vacuole de cap de spermă în sperma de calitate normală, indicând astfel că vacuolele de cap de spermă se găsesc și la bărbații normospermici (Tabelul 1). Deși a existat o proporție mai mare de spermatozoizi cu vacuole de cap la bărbații cu teratozoospermie decât la bărbații cu calitate normală a spermei (90,2% față de 74,6%; ), așa cum se poate observa în tabelul 1, nu este exclus ca vacuolele de cap de spermă să poată fi legate și de patologia spermei la acești bărbați. Mai mult, în sperma bărbaților cu teratozoospermie, a existat o proporție semnificativ mai mică de spermatozoizi optimi din clasa I și o proporție mai mare de spermatozoizi de calitate scăzută din clasele III și IV decât în probele de spermă normală (Tabelul 1)

cu toate acestea, unele studii anterioare au raportat procente mai mari de spermatozoizi vacuolați la bărbații subfertili cu parametri normali ai materialului seminal, variind de la 97,7% la 98,4% . Această discrepanță reflectă faptul că bărbații subfertili cu calitate normală a materialului seminal, dar incluși în programul de fertilizare in vitro, reprezintă o populație eterogenă de bărbați, de la parteneri fertili ai femeilor infertile la bărbați cu rezultate repetate de fertilizare in vitro slabe, în ciuda calității normale a materialului seminal. În plus, există mai multe obiceiuri, stiluri de viață și condiții de sănătate diferite (de exemplu, inflamație și varicocel) care le pot afecta sperma în ceea ce privește vacuolele capului. A existat o corelație pozitivă între proporția de „spermă bună” (clasa I și clasa II) în ceea ce privește vacuolele capului și concentrația spermei și morfologia spermei (procentul spermei normale) la bărbații incluși în acest studiu, așa cum se poate observa în tabelul 2.

mai mult, a existat o corelație pozitivă între proporția spermei de clasa I și concentrația spermei, motilitatea și morfologia. Pe de altă parte, a existat o corelație negativă între proporția de „spermă proastă” (clasa III și clasa IV) în ceea ce privește vacuolele capului și concentrația și morfologia spermei (Tabelul 2). În plus, proporțiile spermei din clasa III și clasa IV au fost corelate negativ cu morfologia spermei, iar proporțiile spermei din clasa IV au fost, de asemenea, corelate negativ cu motilitatea spermei. Toate aceste date indică faptul că vacuolele capului spermei au fost legate de calitatea spermei afectată, deși au fost prezente și în probele normale de spermă. Această constatare este în conformitate cu unele studii anterioare .

interesant, a existat o corelație negativă semnificativă între vârsta masculină și concentrația spermei, în timp ce nu am observat nicio corelație între vacuolele capului spermei și factorii masculi precum vârsta, înălțimea, greutatea și indicele de masă corporală (Tabelul 3).

de asemenea, nu am găsit nicio corelație semnificativă între volumul materialului seminal sau leucocitospermia și vacuolele capului spermei. Pe de altă parte, au existat mai multe studii anterioare care au arătat că unii dintre acești factori masculi pot avea un impact asupra calității spermei și formării vacuolelor capului . Unul dintre aceste studii a arătat că creșterea vârstei masculine și a indicelui de masă corporală sunt legate de creșterea vacuolelor capului spermatozoizilor, dar acest lucru poate fi compensat de o frecvență mai mare a ejaculării și de o perioadă mai scurtă de abstinență sexuală la acești bărbați . Aceasta înseamnă că alți factori masculi încă necunoscuți afectează apariția vacuolelor capului spermei.

3.1.3. Vacuolele capului spermei și rezultatul fertilizării in Vitro

grupurile de bărbați incluse în studiu nu au fost diferite în ceea ce privește vârsta medie a partenerilor de sex feminin și numărul de ovocite pe femeie, principalii factori feminini care pot afecta rezultatul fertilizării in vitro (Tabelul 4). Ratele de sarcină obținute la bărbații teratozoospermici și normozoospermici au fost de 32,5% și 26,8% (vezi Tabelul 4).

printr-o inspecție ulterioară, a devenit clar că proporția de „spermă bună” sau „spermă proastă” în ceea ce privește vacuolele capului din probele de material seminal a fost indicativă pentru o proporție de ovocite fertilizate (rata de fertilizare) după procedura de fertilizare in vitro, dar aceasta depindea de metoda fertilizării in vitro. După fertilizarea clasică in vitro (FIV), a existat o corelație pozitivă semnificativă între procentul de „spermă bună” din proba de material seminal și rata de fertilizare (Tabelul 5). Pe de altă parte, a existat o corelație negativă între proporția de „spermă proastă” și rata de fertilizare, așa cum se poate observa în tabelul 5.

din Figura 2, se poate observa că, în probele de material seminal cu mai mult de ~50% din „sperma proastă” în ceea ce privește vacuolele capului spermei, rata de fertilizare a fost scăzută. Interesant este că nu am observat nicio corelație între vacuolele capului spermei și rata de fertilizare după injecția intracitoplasmatică (ICSI), așa cum au constatat unele studii anterioare . Acest lucru indică faptul că vacuolele capului spermatozoizilor pot afecta un proces fiziologic al spermatozoizilor care sunt necesare pentru fertilizarea clasică in vitro prin inseminare, cum ar fi capacitarea, reacția acrosomului, legarea spermatozoizilor de zona pellucida sau că mai multe selecții de spermatozoizi sunt efectuate de ICSI.

Figura 2

relația dintre vacuolele capului spermei (proporția spermei proaste: Clasa II plus clasa III) în probele de material seminal și rata de fertilizare a ovocitelor după fertilizarea clasică in vitro (FIV).

în ceea ce privește rata de blastocist, a existat o corelație negativă () între procentul de spermatozoizi de clasa III în probele de spermă și rata de blastocist după fertilizarea clasică in vitro, în timp ce nu am observat alte corelații. Nu am observat nicio corelație între vacuolele capului spermei și rata sarcinii, indiferent de metoda de fertilizare in vitro. A existat o relație pozitivă între sarcină și numărul de ovocite recuperate la partenera de sex feminin, așa cum a relevat testul Mann-Whitney, dar nu am găsit nicio relație între sarcină și vacuolele capului spermei. Acest lucru a fost confirmat în continuare de regresia logistică multivariată care respectă factorii feminini și masculi, inclusiv vacuolele capului spermei.

majoritatea studiilor anterioare au încercat să elucideze efectul vacuolelor capului spermatozoizilor asupra rezultatului ICSI la bărbații cu o calitate slabă a materialului seminal, iar unele dintre ele au confirmat într-adevăr efectul negativ . Avantajul studiului nostru este că am elucidat efectul vacuolelor capului spermatozoizilor nu numai asupra rezultatului ICSI în probele de material seminal de calitate slabă (teratozoospermie), ci și asupra rezultatului FIV clasic în probele normale de material seminal (cu parametrii clasici normali ai calității materialului seminal, inclusiv morfologia). Datele noastre indică faptul că vacuolele capului spermei au fost chiar mai dăunătoare pentru rezultatul FIV clasic decât pentru ICSI.

3.2. Microscopia electronică de transmisie (TEM)

în mod similar, ca și prin MSOME, microscopia electronică de transmisie (TEM) a dezvăluit vacuolele capului spermei în probele normale și anormale de spermă. Vacuolele din capetele spermatozoizilor au fost văzute ca zone mai ușoare în interiorul nucleului și au fost prezente în aproape toate spermatozoizii din ambele tipuri de probe de spermă (figurile 3(a) și 3(b)). Micrografele electronice ale vacuolelor capului spermei sunt rareori prezentate în literatură, iar interpretarea ultrastructurii lor este rară . Descrierea structurii fine a spermatozoizilor umani prezintă de obicei zone Lucente mari în capetele spermatozoizilor ca vacuole și zone clare mai mici ca nucleoplasmă sau pete clare .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 3

Micrografe electronice de transmisie (TEM) ale probelor normozoospermice cu vacuole de cap de diferite dimensiuni și poziții. Săgeata indică vacuole pe (b), (c) și RNE în (d). A: acrosom, n: nucleu, m: mitocondrii și RNE: înveliș nuclear redundant.

spre deosebire de micrografele ușoare în care vacuolele sunt văzute ca concavități de suprafață, în micrografele electronice, vacuolele au fost observate ocazional ca bulgări la suprafața celulei (Figura 3(c)). Datorită densității optice diferite a vacuolelor și a cromatinei condensate, indentările nucleare ambalate cu membrane apar ca concavități de suprafață sub microscopie luminoasă.

3.2.1. Caracteristicile ultrastructurale ale vacuolelor capului spermei

micrografele electronice ale vacuolelor capului spermei au arătat indentări nucleare care conțin stive de membrane [figurile 4 (C), 4(d) și 4(f)]. Aceste membrane au fost organizate ca lamele aranjate concentric și sunt descrise ca vârtejuri de membrană (MW), care se umflă ocazional de pe suprafața celulei. Membrane de diferite complexități au fost prezente în diferite zone ale nucleului spermei și pot ocupa o suprafață mare de nucleu atât în spermatozoizi morfologic normali, cât și anormali. În aproape toate cazurile, vârtejurile membranei au fost acoperite de acrosom intact și membrană plasmatică [figurile 4 (c) și 4(d)]. Acestea au fost compuse în cea mai mare parte din membrane duble bine ambalate, cu septa moleculară densă de electroni și membrane mai subțiri care cuprind material floculent (figurile 4(d) și 4(f)). Franklin și Fussell au observat vârtejuri de membrană în spațiul subacrosomal apical al spermatidelor târzii de hamster care erau continue cu învelișul nuclear. Potrivit autorilor, vârtejurile membranei au apărut mai mari și au fost prezente în număr mai mare în faza finală sau de maturare a spermiogenezei.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figura 4

MICROGRAFELE TEM ale vacuolelor capului spermei de normozoospermie ((A), (c), (d), (e) și (f)) și teratozoospermie (b). (a) indentări nucleare cu membrane care cuprind material floculent (asterisc). Membrană dublă cu septa moleculară (săgeată) care iese din învelișul nuclear. (B) nucleu cu pete clare de cromatină necondensată (săgeată) și suprafață mare cu material floculent (asterisc). (c) spirale cu membrană (MW) constând din membrane aranjate concentric. (d) mărirea mare a spiralelor cu membrană de la litera (c). (e) vârtejuri cu membrană (MW) care ocupă o mare parte din nucleu. (f) mărirea mare a membranelor duble cu complexe septale (săgeată) și membrane subțiri (capul săgeții). A: acrosom; n: nucleu.

maturarea spermei duce la reorganizarea nucleară și reducerea dimensiunii sale. Din literatura de specialitate, se știe că maturarea nucleară implică reducerea înveliș nuclear, o membrană dublă dinamică care înconjoară nucleul, separă cromozomii și reglează transportul nuclear prin pori . Multe detalii despre transformarea sa sunt încă neclare. Micrografele noastre de vârtejuri de membrană au arătat continuitatea membranelor cu învelișul nuclear(figurile 5(a) și 5 (c)). Structurile de membrană cu complexe moleculare dense de electroni septate sunt probabil produse în timpul reorganizării anvelopei nucleare. Aceste structuri au fost descrise de mai mulți autori ca plicuri nucleare redundante (RNE) . RNE este văzută în micrograful nostru de spermatozoizi normali(Figura 3 (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 5

secțiuni transversale ale spermatozoizilor în probele normozoospermice ((A), (b) și (c)) cu indentări nucleare mari cu vârtejuri de membrană (MW). Membrana acrosomă este conectată cu plicul nuclear (săgeți). (c) spirale de membrană (MW) cu membrane suplimentare între nucleu și acrosom (vârf de săgeată). (d) o mare parte a cromatinei necondensate cu formare granulară în interiorul nucleului (săgeată) spermatozoizilor cu morfologie anormală. A: acrosom, n: nucleu și C: citoplasmă.

diferite etape ale condensării cromatinei sunt observate în micrografele noastre în toate probele. În Figura 5 (d), putem vedea un spermatozoid cu morfologie anormală într-un proces de condensare a cromatinei care este încă înconjurat de o cantitate mare de citoplasmă. În spermatogeneza târzie, ADN-ul spermei devine strâns împachetat, deoarece histonele sunt înlocuite cu protamine . Cu toate acestea, defectele de condensare apar frecvent și duc la spații clare de formă neregulată de diferite dimensiuni în nucleu . Se știe că eșecul condensării cromatinei este asociat cu prezența vacuolelor mici și mari . Micrografele noastre au dezvăluit zone mai mici de electroni lucenți de cromatină necondensată și vacuole nucleare care diferă ca mărime și conțin întotdeauna material amorf sau/și vârtejuri de membrană. Acestea ar putea fi mai exprimate în spermatozoizi de probe teratozoospermice și pot fi legate de procesul anormal de maturare a spermei și vacuolele capului spermei. Cu toate acestea, este necesară o cercetare mai concentrată.

Acrosomul a fost complet dezvoltat în majoritatea spermatozoizilor cu vacuole de cap de spermă. În unele celule, s-au observat interconexiuni ale membranei acrosomale interioare și ale învelișului nuclear (figurile 5(a) și 5(b)). Morfogeneza acrosomului este un proces dinamic care implică o interacțiune strânsă între complexul Golgi și învelișul nuclear al spermatidei timpurii. S-a demonstrat că Teca perinucleară (PT) este o structură citoscheletală care acoperă nucleul spermei la mamifere și s-a dovedit că joacă un rol important în formarea normală a acrosomilor .

revizuit de Setti și colab. , unii autori raportează că vacuolele spermei sunt de origine acrosomală și reflectă acrosomul nereacționat . Este expusă o relație negativă între prezența vacuolelor și capacitatea spermei de a suferi reacția acrosomală. Datele noastre arată că vacuolele capului spermei sunt structuri unice, de obicei acoperite de acrosom intact.

spermatozoizii anormali au fost prezenți în ambele tipuri de probe de spermă—normale și anormale. Anomaliile au afectat diferite componente ale celulelor spermei, și anume cromatina, acrosomul, regiunea gâtului, mitocondriile și coada. Prezentăm mai multe micrografii de spermatozoizi anormali din probe normozoospermice cu cromatină mai puțin condensată, gât îndoit, acrosom atipic și formă anormală a capului (Figura 6).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 6

(A), (b), (c) și (d) spermatozoizi din probe normale de spermă cu morfologie anormală. Cromatina este granulară și mai puțin condensată cu numeroase pete clare (săgeți albe). Acrosomul este anormal format (a), parțial format (d) și uneori conectat la vârtejurile membranei (b). (c) regiunea gâtului îndoită. A: acrosom; n: nucleu.

3.2.2. Funcția vacuolelor capului spermei

în prezent, este imposibil să se precizeze care este funcția reală a vacuolelor capului spermei. Pe baza micrografelor noastre de ultrastructură a spermei, sugerăm că vacuolele capului spermei pot elimina o substanță de origine necunoscută din cromatină. Deoarece indică relația potențială atât cu procesul de maturare a spermei într-o parte, cât și cu condensarea anormală a cromatinei în cealaltă, se poate specula că vacuolele capului spermei pot fi implicate în îndepărtarea histonelor atunci când sunt înlocuite cu protamine. Dar este prea devreme pentru orice concluzie și sunt necesare cercetări suplimentare.

4. Concluzii

rezultatele acestui studiu indică faptul că probele de spermă ale bărbaților cu teratozoospermie se caracterizează printr-un raport crescut al vacuolelor capului spermei, deși sunt prezente și în probele de spermă ale bărbaților normospermici. Acest lucru indică faptul că acestea pot fi legate de starea patologică. Micrografele noastre pe ultrastructura spermei indică faptul că vacuolele capului spermei sunt compuse din vârtejuri de membrană. Variațiile condensării cromatinei au fost observate în cea mai mare parte la probele anormale de spermă și nu este exclus ca acestea să fie legate de maturizarea anormală și vacuolele capului spermei. Cercetări suplimentare care combină diferite metode și microscopie electronică de transmisie sunt necesare pentru a elucida mai bine acest fenomen.

Conflict de interese

autorii declară că nu au niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.

mulțumiri

autorii ar dori să mulțumească embriologilor clinici ai laboratorului FIV Ljubljana, Departamentul de Obstetrică și Ginecologie, Centrul Medical Universitar Ljubljana, pentru pregătirea materialului seminal și a Laboratorului de microscopie electronică al Departamentului de Biologie, Facultatea Biotehnică, Universitatea din Ljubljana.