Resumo
humano esperma cabeça vacúolos e o seu papel na infertilidade masculina são ainda mal compreendida. O objetivo deste estudo foi identificar as características clínicas e ultraestruturais dos vacúolos da cabeça do esperma humano em homens incluídos no programa de fertilização in vitro: homens com normal (normozoospermia) e morfologia espermática prejudicada (teratozoospermia). As amostras de esperma foram observadas sob ampliação de 6000 vezes usando o exame de morfologia de organela de esperma móvel (MSOME). A proporção de espermatozoides com vacúolos de cabeça foi avaliada e relacionada ao resultado da fertilização in vitro. O esperma de homens com morfologia espermática prejudicada foi caracterizado por uma maior proporção de vacúolos da cabeça espermática. Os vacúolos da cabeça espermática estavam relacionados à qualidade prejudicada do sêmen (concentração espermática, motilidade e morfologia), mas não foram influenciados por fatores masculinos (volume do sêmen, altura, idade, peso ou índice de massa corporal). Além disso, os vacúolos da cabeça espermática estavam relacionados à taxa de fertilização prejudicada apenas após a fertilização in vitro clássica (FIV), enquanto não havia relação com a gravidez. Em um subgrupo de homens, o esperma foi fixado e observado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). O estudo ultraestrutural revelou que os vacúolos da cabeça espermática são grandes recortes nucleares de vários tamanhos e posições, embalados com material membranoso organizado em espirais de membrana (MW).
1. Introdução
a infertilidade masculina pode estar relacionada à morfologia anormal dos espermatozóides. Nos últimos anos, tem havido muito debate sobre um novo parâmetro potencial de qualidade do esperma e fertilidade masculina, vacúolos da cabeça do esperma. Apesar disso, os vacúolos da cabeça do esperma humano e seu papel potencial na infertilidade masculina ainda são mal compreendidos.
usando o exame de morfologia de organela de esperma móvel (MSOME), onde os espermatozóides vivos são visualizados com microscopia Dic Nomarski na ampliação de 6000 vezes, algumas estruturas morfológicas finas são visíveis, o que pode ser útil para determinar a qualidade do esperma. Este método mostra concavidades superficiais pequenas e maiores denominadas vacúolos espermáticos, geralmente localizados na cabeça dos espermatozóides. A natureza e origem dos vacúolos da cabeça do esperma ainda são incertas e não está claro se eles se originam do núcleo ou acrossoma ou outras estruturas membranosas. Os vacúolos também são encontrados em quase todas as amostras com morfologia espermática normal (>14% de espermatozóides morfologicamente normais de acordo com os critérios estritos de Kruger) e estão localizados principalmente na ponta ou na área média das cabeças espermáticas . As imagens tridimensionais de desconvolução, que detectam DNA, mostraram vacúolos como “concavidades nucleares” e microscopia de força atômica revelou membrana plasmática intacta, mas ligeiramente afundada na área de vacúolos . Além disso, as imagens de microscópio eletrônico de amostras de esperma em pacientes com morfologia espermática anormal, teratozoospermia (<14% de espermatozóides normais na amostra de acordo com os critérios estritos de Kruger), mostraram vacúolos exclusivamente na área do núcleo espermático . A localização anterior dos vacúolos da cabeça do esperma levou à questão sobre sua possível origem do acrossoma. A indução da reação do acrossoma por ionóforo A23587, líquido folicular e ácido hialurônico diminuiu a porcentagem de espermatozóides com vacúolos da cabeça, o que sugeriu que eles poderiam estar relacionados ao acrossoma. No entanto, os vacúolos também estão presentes nas amostras de esperma sem acrossoma (ou seja, globozoospermia), sugerindo que eles não se originam do acrossoma . Foi demonstrado que amostras com grandes vacúolos de cabeça de esperma (mais de 13% da superfície da cabeça) têm maior porcentagem de DNA fragmentado em comparação com aqueles com pequenos vacúolos, bem como maior frequência de anormalidades cromossômicas . Os vacúolos da cabeça espermática observados sob a alta ampliação da microscopia de luz foram descritos como concavidades nucleares” semelhantes a bolsas ” relacionadas à falha da condensação da cromatina . Pelo contrário, alguns pesquisadores não encontraram nenhuma correlação entre os grandes vacúolos da cabeça do esperma e danos ao DNA ou anormalidades cromossômicas . A modelagem do núcleo espermático durante a espermiogênese envolve nucleoproteínas, manchete microtubular e material perinuclear que é conhecido por participar da ancoragem do acrossoma no núcleo e também constitui a teca perinuclear . Durante a espermiogênese, o núcleo torna-se notavelmente reduzido e os nucleossomos geralmente aparecem Não aleatoriamente distribuídos por todo o genoma. O DNA ligado ao nucleossomo pode permanecer montado com matriz nuclear e é visto como “espaço vazio” em imagens eletrônicas. Juntos, eles poderiam ter um papel importante na estrutura da cromatina paterna após a fertilização . Nos últimos passos da espermiogênese, o DNA nuclear torna-se altamente condensado porque as nucleoproteínas histonas são substituídas por protaminas . Durante a substituição das nucleoproteínas, muitas proteínas temporariamente funcionais são formadas e degradadas em locais especiais de degradação. As bolsas nucleares na base da cabeça espermática foram propostas para funcionar como Centros proteolíticos e o local de saída de onde os resíduos de proteína saem do núcleo e podem estar funcionalmente conectados com vacúolos .
os vacúolos da cabeça espermática são um parâmetro interessante, mas pouco compreendido, da qualidade espermática e da fertilidade masculina, que parecem estar relacionados ao resultado da fertilização in vitro em homens com qualidade espermática prejudicada . A origem e a dinâmica dos vacúolos da cabeça do esperma não são bem compreendidas e seu papel na função espermática é discutível. Alguns autores sugerem que os vacúolos espermáticos são características normais da cabeça espermática, enquanto outros os descrevem como estruturas degenerativas relacionadas à subferilidade masculina . Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar as porcentagens de espermatozóides com vacúolos de cabeça tanto nas amostras normais de espermatozóides quanto nas amostras com morfologia espermática prejudicada e relacioná-las ao resultado da fertilização in vitro. Além disso, a ultraestrutura e a função dos vacúolos da cabeça espermática foram reconsideradas em relação à maturação espermática, usando a alta resolução da microscopia eletrônica de transmissão.
2. Materiais e Métodos
neste estudo, as amostras de esperma de 81 homens incluídos para a fertilização in vitro programa foram examinados: 40 homens com esperma normal morfologia e 41 homens com a morfologia dos espermatozóides anormais (teratozoospermia) de acordo com Kruger critérios rigorosos (anormal: <14% de espermatozóides normais). As amostras de esperma foram preparadas e utilizadas para fertilização in vitro. Cada amostra de esperma foi preparada por centrifugação (300 g) por 20 min em gradiente de densidade de 100%/40% de PureSperm (Nidacon, Suécia) seguido pela técnica de natação, onde os melhores espermatozóides foram extraídos da amostra. Todas as amostras normais de espermatozóides foram usadas para fertilização in vitro clássica (FIV), enquanto as amostras com morfologia espermática anormal foram usadas para injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) para fertilizar os oócitos da Parceira. As amostras, que permaneceram após a fertilização in vitro, foram usadas para o exame de morfologia de organelas de espermatozóides móveis (MSOME) para avaliar a porcentagem de vacúolos de cabeça de espermatozóides em cada amostra sob ampliação de 6000 vezes. As porcentagens de espermatozóides com vacúolos de cabeça e o resultado da fertilização in vitro foram comparados entre as amostras de espermatozóides normais e anormais. Usando a alta resolução da microscopia eletrônica de transmissão (TEM), foi observada a ultraestrutura de 10 amostras de homens normozoospérmicos e 6 amostras de homens teratozoospérmicos. A função potencial e a estrutura dos vacúolos foram pesquisadas, também em relação ao processo de maturação espermática.
esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê Nacional de Ética Médica.
2.1. Foram avaliados parâmetros clássicos de qualidade do sêmen
os parâmetros clássicos, concentração e motilidade espermática e morfologia de cada amostra espermática. A amostra espermática deveria ser normal na concentração ≥15 milhões de espermatozóides por mL e ≥40% de espermatozóides móveis totais (progressivos e não progressivos) de acordo com os critérios da OMS e ≥14% de espermatozóides morfologicamente normais de acordo com os critérios rigorosos de Kruger.
2.2. Exame de Morfologia de organela de esperma móvel(MSOME)
para exame de morfologia de organela de esperma móvel, usamos gotículas de meio de SpermSlow (Origio, Dinamarca) em um prato de fundo de vidro (GWSt1000; Will Co, Wells, Amsterdã, Holanda) e gotículas de amostra de esperma preparadas pela técnica swim-up, anteriormente descrita por Knez . Os espermatozóides em cada amostra foram monitorados sob um microscópio invertido com um estágio aquecido equipado com contraste de interferência diferencial (Eclipse TE2000-s; Nikon, Japão). Uma gota fina e alongada de Espermasmeio baixo (Origio, Dinamarca) foi colocado no fundo de um prato de vidro. Uma gota menor de espermatozóides preparados foi colocada perto da gota de SpermSlow e espermatozóides ligados ao hialuronato. Todas as gotículas foram cobertas com óleo de parafina para evitar a secagem da amostra de esperma. Para observação sob ampliação de 6000, uma gota de óleo de imersão foi inserida sob a placa de vidro (sob a gota SpermSlow). Uma gota de SpermSlow com espermatozóides ligados foi monitorada pelo objetivo de imersão, contraste de interferência diferencial e uma câmera Nikon Digital Sight DS-Ri1. Em cada amostra, 200 espermatozóides ligados ao hialuronato foram escolhidos e avaliados de acordo com vacúolos de cabeça, com ampliação de 6000 vezes. O sistema de pontuação para a avaliação de cada espermatozóide foi baseado na seguinte classificação de Vanderzwalmen . De acordo com o número de vacúolos e seu tamanho, os espermatozóides foram classificados nas seguintes: Classe I: ausência de vacúolos, Classe II: máximo de dois pequenos vacúolos, Classe III: mais do que dois pequenos vacúolos ou pelo menos um grande vacúolo, e Classe IV: grandes vacúolos em conjunto com o anormal formas de cabeça ou outras anormalidades. Em cada amostra de espermatozoides, foram avaliadas as proporções dos espermatozoides Classe I, classe II, classe III e classe IV. Para estatísticas, as proporções de espermatozóides de classe I e classe II Foram combinadas em um grupo, “esperma bom”, e as proporções de espermatozóides de classe III e classe IV em um grupo, “esperma ruim”, em 3 Termos de vacúolos de cabeça de esperma.
2.3. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
Para descrever o ultraestrutural características de vacúolos no esperma núcleo, escolhido esperma amostras foram centrifugadas a 500 g por 10 minutos à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos e os pellets foram fixados em glutaraldeído a 2,5% e paraformaldeído a 1% em 0.1 m PB (tampão fosfato de Sörensen), pH 7,0 por 24 h a 4°C, pós-misturado com 1% de OsO4 em 0,1 M PB por 1,5 h E incorporado em resina de ágar 100 (ágar científico). Seções ultrafinas foram coradas com solução de água a 4% de acetato de uranilo e citrato de chumbo de Reynolds. As amostras foram examinadas com microscópio eletrônico Philips CM 100 (FEI, Holanda), operando a 80 kV; as imagens foram gravadas com Bioscan 792 e Orius 200 camera (Gatan) usando Micrografia Digital, Software (Gatan Inc., Washington, DC, EUA) em ampliações de 1100 a 92000 vezes.
2.4. A Análise estatística
A significância estatística de diferenças nas percentagens de espermatozóides com esperma cabeça vacúolos e o resultado de fertilização in vitro (taxa de gravidez) entre o esperma normal amostras e amostras com morfologia anormal (teratozoospermia) foram avaliadas pelo teste de qui-quadrado. As percentagens de “bom esperma” (Classe I e Classe II), “bad esperma” (Classe III e Classe IV), e Classe I, Classe II, Classe III e Classe IV do esperma em termos de esperma cabeça vacúolos foram correlacionados com os parâmetros clássicos de qualidade do sêmen (concentração, motilidade e morfologia), fatores masculinos (volume de sêmen, leukocytospermia, idade, altura, peso e índice de massa corporal), e o resultado de fertilização in vitro (fiv (fertilização, blastocisto, e as taxas de gravidez) de Spearman rho de correlação. Para o resultado da fertilização in vitro, os dados foram avaliados para ciclos totais de fertilização in vitro e separadamente para fertilização in vitro clássica (FIV) e injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). A dependência da gravidez de fatores femininos e masculinos (incluindo vacúolos da cabeça do esperma) foi avaliada por regressão logística multivariada. A significância estatística foi definida em.
3. Resultados e discussão
3.1. Exame morfológico da organela do esperma móvel(MSOME)
3.1.1. Vacúolos da cabeça do esperma, como visto por microscopia de luz de MSOME
em ambos, as amostras de esperma normais e anormais, os vacúolos estavam localizados em diferentes partes da cabeça dos espermatozóides. Eles foram vistos como concavidades de superfície ou áreas translúcidas mais leves de vários tamanhos e números. Na literatura, os vacúolos da cabeça do esperma são descritos como concavidades de superfície , concavidades nucleares semelhantes a bolsas ou impressões digitais nucleares sob o microscópio de luz. Em nosso estudo, o MSOME, usando microscopia Nomarski DIC com ampliação de 6000 vezes, mostrou vacúolos de cabeça de esperma como concavidades de superfície (Figura 1). No entanto, devemos levar em consideração que a microscopia Nomarski Dic resulta em uma imagem pseudo-3D devido à refração da luz que passa pela amostra de diferentes espessuras e densidade óptica. Portanto, é possível que regiões nucleares de diferentes densidades ópticas não sejam apenas concavidades, mas também protuberâncias irregulares na superfície celular.
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Esperma com a cabeça vacúolos no normozoospermic (a), (c) e (e)) e teratozoospermic (b), (d) e (f)) amostras observadas com microscopia DIC (Nomarski) em ampliação de 6000 vezes.
3.1.2. Vacúolos da cabeça do esperma, parâmetros clássicos da qualidade do esperma e fatores masculinos
nossos dados mostram que os vacúolos da cabeça do esperma estavam presentes nas amostras de esperma normais e anormais (Figura 1). Curiosamente, houve uma proporção relativamente alta (74,6%) de espermatozóides com vacúolos de cabeça de esperma no esperma de qualidade normal, indicando assim que os vacúolos de cabeça de esperma também são encontrados em homens normospérmicos (Tabela 1). Apesar de haver uma maior proporção de espermatozóides com cabeça de vacúolos em homens com teratozoospermia do que no homem normal com a qualidade do esperma (90.2% versus 74.6%; ), como pode ser visto na Tabela 1, não é de excluir que o esperma cabeça vacúolos podem também estar relacionados com o esperma de patologia nestes homens. Além disso, no esperma de homens com teratozoospermia, houve um número significativamente menor proporção ideal de espermatozóides de Classe I e de uma maior proporção de baixa qualidade do esperma das Classes III e IV do que em amostras de espermatozóides normais (Tabela 1)
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| diferença Estatisticamente significativa (). **diferença estatisticamente significativa (), conforme revelado pelo teste do Qui-quadrado. |
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no entanto, alguns estudos anteriores relataram maiores porcentagens de espermatozóides vacuolados em homens subferteis com parâmetros normais de sêmen, variando de 97,7% a 98,4% . Essa discrepância reflete o fato de que os homens subferteis com qualidade normal do sêmen, mas incluídos no programa de fertilização in vitro, representam uma população heterogênea de homens, de parceiros férteis de mulheres inférteis a homens com resultados repetidos de fertilização in vitro pobres, apesar da qualidade normal do sêmen. Além disso, existem vários hábitos, estilos de vida e condições de saúde diferentes (por exemplo, inflamação e varicocele) que podem afetar seus espermatozóides em termos de vacúolos da cabeça. Houve uma correlação positiva entre a proporção de “bom esperma” (Classe I e Classe II) em termos de cabeça vacúolos e concentração de espermatozóides e a morfologia dos espermatozóides (percentagem de espermatozóides normais) em homens incluídos neste estudo, como pode ser visto na Tabela 2.
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| Correlação é significativa ao nível 0.05 (2-tailed). * * a correlação é significativa no nível 0,01 (2 caudas). |
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além disso, houve uma correlação positiva entre a proporção de esperma de classe I e concentração de esperma, motilidade e morfologia. Por outro lado, houve uma correlação negativa entre a proporção de “espermatozoides ruins” (Classe III e classe IV) em termos de vacúolos da cabeça e concentração e morfologia do esperma (Tabela 2). Além disso, as proporções de espermatozóides de classe III e classe IV foram negativamente correlacionadas com a morfologia espermática e as proporções de espermatozóides de classe IV também foram negativamente correlacionadas com a motilidade espermática. Todos esses dados indicam que os vacúolos da cabeça do esperma estavam relacionados à qualidade prejudicada do esperma, embora também estivessem presentes em amostras normais de esperma. Este achado está de acordo com alguns estudos anteriores .Curiosamente, houve uma correlação negativa significativa entre a idade masculina e a concentração de espermatozoides, enquanto não observamos nenhuma correlação entre os vacúolos da cabeça espermática e fatores masculinos como idade, altura, peso e índice de massa corporal (Tabela 3).
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| Correlação é significativa ao nível 0.05 (2-tailed). IMC: Índice de massa corporal. |
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também não encontramos nenhuma correlação significativa entre o volume de sêmen ou leucocitospermia e vacúolos da cabeça do esperma. Por outro lado, houve mais estudos anteriores que mostraram que alguns desses fatores masculinos podem ter um impacto na qualidade do esperma e na formação de vacúolos na cabeça . Um desses estudos mostrou que o aumento da idade masculina e do Índice de massa corporal está relacionado ao aumento dos vacúolos da cabeça do esperma, mas isso pode ser compensado por uma maior frequência de ejaculação e um período mais curto de abstinência sexual nesses homens . Isso significa que alguns outros fatores masculinos ainda desconhecidos afetam a aparência dos vacúolos da cabeça do esperma.
3.1.3. Esperma Cabeça Vacúolos e o Resultado de Fertilização In Vitro
Os grupos de homens incluídos no estudo não diferiram em relação a média de idade das mulheres e o número de oócitos por mulher, os principais fatores femininos que podem afetar os resultados de fertilização in vitro (Tabela 4). As taxas de gravidez alcançadas em homens teratozoospérmicos e normozoospérmicos foram de 32,5% e 26,8% (Ver Tabela 4).
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| A significância estatística foi definido . | ||||||||||||||||||||||||||||||
Por mais de inspeção, tornou-se claro que a proporção de “bom esperma” ou “ruim esperma” em termos de cabeça vacúolos em amostras de sêmen foi indicativo de uma proporção de oócitos fertilizados (taxa de fertilização) após o procedimento de fertilização in vitro, mas depende do método de fertilização in vitro. Após a fertilização in vitro clássica (FIV), houve uma correlação positiva significativa entre a porcentagem de “bons espermatozoides” na amostra de sêmen e a taxa de fertilização (Tabela 5). Por outro lado, houve correlação negativa entre a proporção de “espermatozoides ruins” e a taxa de fecundação, como pode ser visto na Tabela 5.
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| Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). IVF: classical in vitro fertilization; ICSI: intracytoplasmic sperm injection. |
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na Figura 2, pode-se ver que, em amostras de sêmen com mais de ~50% de “espermatozóides ruins” em termos de vacúolos da cabeça do esperma, a taxa de fertilização foi diminuída. Curiosamente, não observamos nenhuma correlação entre os vacúolos da cabeça espermática e a taxa de fertilização após a injeção intracitoplasmática (ICSI), conforme encontrado por alguns estudos anteriores . Isso indica que os vacúolos da cabeça do esperma podem prejudicar algum processo fisiológico de espermatozóides que são necessários para a fertilização in vitro clássica por inseminação, como capacitação, reação do acrossoma, ligação do esperma à zona pelúcida, ou que mais alguma seleção do esperma é realizada pelo ICSI.
Relação entre o esperma cabeça vacúolos (proporção de mau esperma: Classe II plus Classe III) em amostras de sêmen e óvulos taxa de fertilização após o clássico de fertilização in vitro (FIV).
em relação à taxa de blastocisto, houve correlação negativa () entre a porcentagem de espermatozóides de classe III em amostras de sêmen e a taxa de blastocisto após a fertilização in vitro clássica, enquanto não observamos outras correlações. Não foi observada correlação entre vacúolos da cabeça espermática e taxa de gravidez, independentemente do método de fertilização in vitro. Houve uma relação positiva entre a gravidez e o número de oócitos recuperados na parceira, conforme revelado pelo teste de Mann-Whitney, mas não encontramos nenhuma relação entre a gravidez e os vacúolos da cabeça espermática. Isso foi confirmado por regressão logística multivariada, respeitando fatores femininos e masculinos, incluindo vacúolos da cabeça do esperma.
a maioria dos estudos anteriores tentou elucidar o efeito dos vacúolos da cabeça do esperma no resultado da ICSI em homens com má qualidade do sêmen e alguns deles realmente confirmaram o efeito negativo . A vantagem do nosso estudo é que nós elucidado o efeito de esperma cabeça vacúolos não apenas sobre os resultados da ICSI em amostras de sêmen de má qualidade (teratozoospermia), mas também sobre os resultados de FIV clássica em amostras de sêmen normais (normal clássica parâmetros da qualidade do sêmen, incluindo morfologia). Nossos dados indicam que os vacúolos da cabeça espermática foram ainda mais deletérios para o resultado da fertilização in vitro clássica do que para ICSI.
3.2. Microscopia Eletrônica de transmissão (TEM)
da mesma forma, como por MSOME, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) revelou os vacúolos da cabeça do esperma em amostras de esperma normais e anormais. Os vacúolos nas cabeças espermáticas foram vistos como áreas mais leves dentro do núcleo e estavam presentes em quase todos os espermatozóides em ambos os tipos de amostras de esperma (Figuras 3(A) e 3(b)). As micrografias eletrônicas dos vacúolos da cabeça espermática raramente são apresentadas na literatura e a interpretação de sua ultraestrutura é escassa . A descrição da estrutura fina dos espermatozóides humanos geralmente apresenta grandes áreas lucent em cabeças de espermatozóides como vacúolos e áreas claras menores como nucleoplasma ou manchas claras .
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micrografia eletrônica de Transmissão (TEM) de normozoospermic amostras com a cabeça vacúolos de vários tamanho e posição. Seta indica vacúolos em (b), (c) e RNE Em (d). A: acrossoma, n: Núcleo, M: mitocôndria e RNE: envelope nuclear redundante.
ao contrário das micrografias leves onde os vacúolos são vistos como concavidades de superfície, nas micrografias de elétrons, os vacúolos foram ocasionalmente observados como protuberâncias na superfície celular (Figura 3(c)). Devido à densidade ótica diferente dos vacúolos e da cromatina condensada, os recortes nucleares embalados com membranas aparecem como concavidades de superfície sob microscopia de luz.
3.2.1. Características ultraestruturais dos vacúolos da cabeça espermática
micrografias eletrônicas dos vacúolos da cabeça espermática mostraram recortes nucleares contendo pilhas de membranas(Figuras 4(c), 4(d) e 4 (f)). Essas membranas foram organizadas como lamelas concentricamente dispostas e são descritas como espirais de membrana (MW), que ocasionalmente se projetam da superfície celular. Espirais de membrana de várias complexidades estavam presentes em diferentes áreas do núcleo espermático e podem ocupar uma grande área do núcleo em espermatozóides morfologicamente normais e anormais. Em quase todos os casos, os espirais de membrana foram cobertos por acrossoma intacto e membrana plasmática (Figuras 4(c) e 4(d)). Eles eram compostos principalmente de membranas duplas compactadas com septos moleculares densos em elétrons e membranas mais finas envolvendo material floculento (Figuras 4(d) e 4(f)). Franklin e Fussell observaram espirais de membrana no espaço subacrossômico apical de espermátides tardias de hamster que eram contínuas com o envelope nuclear. Segundo os autores, os espirais de membrana pareciam maiores e estavam presentes em maior número na fase final ou de maturação da espermiogênese.
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TEM-micrografias de esperma cabeça vacúolos de normozoospermia (a), (c), (d), (e) e (f)) e teratozoospermia (b). (a) recortes nucleares com membranas envolvendo Material floculante (asterisco). Membrana dupla com septos moleculares (seta) emergindo do envelope nuclear. (B) núcleo com manchas claras de cromatina não condensada (seta) e grande área com material floculento (asterisco). (C) espirais de membrana (MW) consistindo em membranas concentricamente dispostas. (d) ampliação alta dos espirais da membrana de (c). (e) espirais de membrana (MW) ocupando uma grande parte do núcleo. (F) alta ampliação de membranas duplas com complexos septais (seta) e membranas finas (cabeça de seta). A: acrossoma; n: Núcleo.
a maturação do esperma leva à reorganização nuclear e redução de seu tamanho. A partir da literatura, sabe-se que a maturação nuclear envolve a redução do envelope nuclear, uma membrana dupla dinâmica que envolve o núcleo, segrega cromossomos e regula o transporte nuclear através dos poros . Muitos detalhes de sua transformação ainda não estão claros. Nossas micrografias de espirais de membrana mostraram continuidade das membranas com o envelope nuclear (figuras 5(A) e 5(c)). Estruturas de membrana com complexos moleculares densos de elétrons septados são provavelmente produzidas durante a reorganização do envelope nuclear. Essas estruturas foram descritas por vários autores como envelope nuclear redundante (RNE) . O RNE É visto em nossa micrografia de espermatozóides normais (Figura 3 (d)).
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secções transversais de espermatozóides no normozoospermic amostras (a), (b)e (c)) com grande nuclear recortes com membrana de giros (MW). A membrana do acrossoma é conectada com envelope nuclear (setas). (C) espirais de membrana (MW) com membranas adicionais entre núcleo e acrossoma (ponta de seta). (d) grande parte da cromatina não condensada com formação granular dentro do núcleo (seta) do espermatozóide com morfologia anormal. A: acrossoma, n: núcleo e C: citoplasma.
diferentes estágios de condensação da cromatina são vistos em nossas micrografias em todas as amostras. Na Figura 5 (d), podemos ver um espermatozóide com morfologia anormal em um processo de condensação de cromatina que ainda é cercado por grande quantidade de citoplasma. Na espermatogênese tardia, o DNA do esperma fica bem embalado porque as histonas são substituídas por protaminas . No entanto, defeitos de condensação freqüentemente ocorrem e resultam em espaços claros de forma irregular de vários tamanhos no núcleo . Sabe-se que a falha de condensação da cromatina está associada à presença de vacúolos pequenos e grandes . Nossas micrografias revelaram áreas menores de Lucent de elétrons de cromatina não condensada e vacúolos nucleares que diferem em tamanho e sempre contêm material amorfo ou/e espirais de membrana. Eles podem ser mais expressos em espermatozóides de amostras teratozoospérmicas e podem estar relacionados ao processo anormal de maturação espermática e aos vacúolos da cabeça espermática. No entanto, pesquisas mais focadas são necessárias.
acrossoma foi totalmente desenvolvido na maioria dos espermatozóides com vacúolos de cabeça de esperma. Em algumas células, foram observadas interconexões da membrana acrossomal interna e do envelope nuclear (figuras 5(A) e 5(b)). A morfogênese do acrossoma é um processo dinâmico que envolve uma interação próxima entre o complexo de Golgi e o envelope nuclear do espermatozóide precoce. Foi demonstrado que a teca perinuclear (PT) é uma estrutura citoesquelética que cobre o núcleo espermático em mamíferos e demonstrou desempenhar um papel importante na formação normal de acrossomas .
conforme revisado por Setti et al. , alguns autores relatam que os vacúolos espermáticos são de origem acrossômica e refletem o acrossoma não reagido . Uma relação negativa entre a presença de vacúolos e a capacidade espermática de sofrer a reação acrossômica é exposta. Nossos dados mostram que os vacúolos da cabeça do esperma são estruturas únicas, geralmente cobertas por acrossoma intacto.Espermatozóides anormais estavam presentes em ambos os tipos de amostras de esperma—normais e anormais. Anormalidades afetaram diferentes componentes dos espermatozóides, a saber, cromatina, acrossoma, região do pescoço, mitocôndrias e cauda. Apresentamos várias micrografias de espermatozóides anormais de amostras normozoospérmicas com cromatina menos condensada, pescoço dobrado, acrossoma atípico e formato anormal da cabeça (Figura 6).
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(a), (b), (c), e (d) de Espermatozóides normais de espermatozóides em amostras com morfologia anormal. A cromatina é granular e menos condensada com numerosas manchas claras (setas brancas). O acrossoma é anormalmente formado (a), parcialmente formado (d) e às vezes conectado a espirais de membrana (b). c) região do pescoço Dobrada. A: acrossoma; n: Núcleo.
3.2.2. Função dos vacúolos Da Cabeça do esperma
atualmente, é impossível afirmar qual é a função real dos vacúolos da cabeça do esperma. Com base em nossas micrografias de ultraestrutura espermática, sugerimos que os vacúolos da cabeça espermática possam remover alguma substância de origem desconhecida da cromatina. Porque eles indicam a potencial relação ao processo de maturação do esperma em um lado e anormal condensação da cromatina, no outro, pode-se especular que o esperma cabeça vacúolos podem estar envolvidos na remoção de histonas, quando substituídos por protamines. Mas é muito cedo para qualquer conclusão e mais pesquisas são necessárias.
4. Conclusões
Os resultados deste estudo indicam que amostras de esperma de homens com teratozoospermia são caracterizadas pelo aumento da proporção de espermatozóides cabeça vacúolos, apesar de estarem presentes também em amostras de esperma de normospermic homens. Isso indica que eles podem estar relacionados ao estado patológico. Nossas micrografias na ultraestrutura do esperma indicam que os vacúolos da cabeça do esperma são compostos de espirais de membrana. Variações na condensação da cromatina foram observadas principalmente em amostras anormais de esperma e não é excluído que elas estejam relacionadas à maturação anormal e aos vacúolos da cabeça do esperma. Mais pesquisas combinando diferentes métodos e microscopia eletrônica de Transmissão são necessárias para melhor elucidar esse fenômeno.
conflito de interesses
os autores declaram que não têm conflito de interesses em relação à publicação deste artigo.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer os embriologistas clínicos do Laboratório de FERTILIZAÇÃO in vitro Ljubljana, Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, Centro Médico da Universidade de Liubliana, para a preparação do sêmen e do Laboratório de Microscopia do Departamento de Biologia, Biotecnológico Faculdade, Universidade de Ljubljana.