struktura i funkcja peptydazy sygnałowej Lively, Mark O. Wake Forest University Health Sciences, Winston-Salem, NC, Stany Zjednoczone

peptydaza sygnałowa jest enzymem proteolitycznym związanym z błoną, który rozszczepia peptydy sygnałowe z białek wydzielniczych skierowanych do światła retikulum endoplazmatycznego. Aktywność enzymu jest związana z kompleksem od dwóch do pięciu integralnych białek błonowych z ich domenami kulistymi po stronie lumenalnej retikulum endoplazmatycznego. Enzym jest niezbędny do przetrwania drożdży i uważa się go za niezbędny Gen wszystkich organizmów eukariotycznych. Opisano mutacje w białkach wydzielniczych wpływających na rozszczepienie peptydu sygnałowego przez peptydazę sygnałową, które prowadzą do hemofilii (czynnik krzepnięcia X), rodzinnej cukrzycy neurohipophyseal lipidus (wazopresyna) i postaci rodzinnej niedoczynności przytarczyc (parathormon). Wiele innych takich dziedzicznych wad prawdopodobnie istnieje, ale nie zostały rozpoznane. Ze względu na centralną rolę tego enzymu w biosyntezie i wydzielaniu białek, ważne jest, aby w pełni zrozumieć jego funkcję i rolę w translokacji białka do retikulum endoplazmatycznego. Mechanizm katalityczny peptydazy sygnałowej mikrosomalnej wydaje się być nowatorski i wielu definiuje nową mechanistyczną klasę proteinazy. Sekwencje aminokwasowe znanych białek peptydazy sygnałowej nie są związane z żadną z dobrze ugruntowanych rodzin proteinaz. Głównym celem tego projektu jest określenie właściwości strukturalnych i funkcjonalnych peptydazy sygnałowej retikulum endoplazmatycznego komórek zwierzęcych. Projekt ma trzy konkretne cele: 1) Identyfikacja katalitycznie funkcjonalnych reszt aminokwasowych; 2) określenie rozszerzonej specyficzności rozszczepiania substratu; i 3) identyfikacja składników białkowych peptydazy sygnałowej mikrosomalnej, które są niezbędne do przetwarzania peptydów sygnałowych. Specyficzne, nieodwracalne inhibitory aktywności peptydazy sygnałowej zostaną wykorzystane do zlokalizowania i identyfikacji reszt aminokwasowych wymaganych do katalizy. Zmodyfikowane białka i fragmenty peptydowe hamowanej peptydazy będą oczyszczane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i analizowane za pomocą analizy sekwencji kwasu animo i/lub spektrometrii masowej jonizacji elektroopryskowej. Dodatkowe, bardziej specyficzne inhibitory peptydazy sygnałowej zostaną przygotowane. Modelowy substrat peptydazy sygnałowej preproteiny zostanie zmodyfikowany przez ukierunkowaną mutagenezę i wykorzystany do ujawnienia strukturalnych determinantów peptydów sygnałowych, które definiują rozszerzone miejsce wiązania substratu. Mikrosomalna peptydaza sygnałowa będzie wyrażana w hodowli tkankowej i komórkach bakteryjnych w celu identyfikacji poszczególnych składników białkowych niezbędnych i wystarczających do rozpoznania i rozszczepiania peptydów sygnałowych in vivo. Badania strukturalne i mechanistyczne będą znacznie ułatwione dzięki zdolności do wytwarzania i oczyszczania enzymatycznie aktywnego, rekombinowanego kompleksu peptydazy sygnałowej. Osiągnięcie tego celu pozwoli na precyzyjne określenie mechanizmu działania tej niezwykłej proteinazy związanej z błoną.