cechy kliniczne i strukturalne wakuoli głowy spermy u mężczyzn objętych programem zapłodnienia in Vitro

Streszczenie

wakuole głowy spermy ludzkiej i ich rola w niepłodności męskiej są nadal słabo poznane. Celem pracy była identyfikacja cech klinicznych i ultrastrukturalnych wakuoli głowy ludzkiego nasienia u mężczyzn objętych programem zapłodnienia in vitro: u mężczyzn z prawidłową (normozoospermia) i zaburzoną morfologią plemników (teratozoospermia). Próbki plemników obserwowano w powiększeniu 6000-krotnym przy użyciu badania morfologii organelle plemników ruchomych (MSOME). Oceniano odsetek plemników z wakuolami głowy i zależał od wyniku zapłodnienia in vitro. Plemniki mężczyzn z zaburzeniami morfologii plemników charakteryzowały się wyższym odsetkiem wakuoli głowy plemników. Wakuole głowy plemników były związane z zaburzeniami jakości nasienia (stężenie plemników, ruchliwość i morfologia), ale nie miały wpływu czynniki męskie (objętość nasienia, wzrost, wiek, masa ciała lub wskaźnik masy ciała). Co więcej, wakuole głowy plemników były związane z upośledzonym tempem zapłodnienia dopiero po klasycznym zapłodnieniu in vitro (IVF), podczas gdy nie było związku z ciążą. W podgrupie mężczyzn plemniki były utrwalane i obserwowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (tem). Badanie ultrastrukturalne ujawniło, że wakuole głowy plemnika są dużymi wcięciami jądrowymi o różnych rozmiarach i pozycjach, wypełnionymi materiałem błoniastym zorganizowanym w przęsła membranowe (MW).

1. Wprowadzenie

niepłodność męska może być związana z nieprawidłową morfologią plemników. W ostatnich latach było wiele dyskusji na temat nowego potencjalnego parametru jakości nasienia i płodności męskiej, wakuoli głowy spermy. Mimo to wakuole głowy ludzkiej spermy i ich potencjalna rola w niepłodności męskiej są nadal słabo poznane.

wykorzystując badanie morfologiczne organelle plemników (MSOME), w którym żywe plemniki są wizualizowane za pomocą mikroskopii DIC Nomarskiego w powiększeniu 6000 razy, widoczne są drobne struktury morfologiczne, które mogą być przydatne do określenia jakości plemników. Metoda ta pokazuje małe i większe wklęsłości powierzchniowe zwane wakuolami plemników, zwykle zlokalizowane w głowie plemników. Natura i pochodzenie wakuoli głowy plemnika są nadal niepewne i nie jest jasne, czy pochodzą one z jądra lub akrosomu lub innych struktur błoniastych. Wakuole występują również w prawie wszystkich próbkach o prawidłowej morfologii plemników (>14% morfologicznie prawidłowych plemników według ścisłych kryteriów Krugera) i znajdują się głównie na czubku lub środkowej części głów plemników . Trójwymiarowe obrazy dekonwolucji, które wykrywają DNA, wykazały wakuole jako „wklęsłości jądrowe”, a mikroskopia sił atomowych ujawniła nienaruszoną, ale lekko zatopioną błonę plazmową w obszarze wakuoli . Ponadto, zdjęcia próbek plemników w mikroskopie elektronowym u pacjentów z nieprawidłową morfologią plemników, teratozoospermia (< 14% prawidłowych plemników w próbce według ścisłych kryteriów Krugera), wykazały wakuole wyłącznie w obszarze jądra plemnika . Przednia lokalizacja wakuoli głowy plemników doprowadziła do pytania o ich możliwe pochodzenie z akrosomu. Indukcja reakcji akrosomu przez jonofor A23587, płyn pęcherzykowy i kwas hialuronowy zmniejszyła odsetek plemników z wakuolami głowy, co sugerowało, że mogą one być związane z akrosomem. Jednak wakuole są również obecne w próbkach plemników bez akrosomu (tj. globozoospermia), co sugeruje, że nie pochodzą one z akrosomu . Wykazano, że próbki z dużymi wakuolami głowy plemników (ponad 13% powierzchni głowy) mają większy odsetek fragmentowanego DNA w porównaniu z próbkami z małymi wakuolami, a także większą częstotliwość nieprawidłowości chromosomowych . Wakuole głowy plemnika obserwowane przy dużym powiększeniu mikroskopii świetlnej zostały opisane jako” kieszonkowe ” wklęsłości jądrowe związane z awarią kondensacji chromatyny . Wręcz przeciwnie, niektórzy badacze nie znaleźli żadnej korelacji między dużymi wakuolami głowy plemnika a uszkodzeniem DNA lub nieprawidłowościami chromosomów . Modelowanie jądra plemnika podczas spermiogenezy obejmuje nukleoproteiny, mikrotubular manchette i materiał okołojądrowy, o którym wiadomo, że uczestniczy w zakotwiczeniu akrosomu w jądrze, a także stanowi okołojądrową Teca . Podczas spermiogenezy jądro zostaje uderzająco zredukowane, a nukleosomy zwykle pojawiają się nierentownie w całym genomie. DNA związane z nukleosomem może pozostać zmontowane z macierzą jądrową i jest postrzegane jako „pusta przestrzeń” w obrazach elektronicznych. Razem mogą odgrywać ważną rolę w strukturze chromatyny ojcowskiej po zapłodnieniu . W późnych etapach spermiogenezy DNA jądrowe staje się silnie skondensowane, ponieważ histony nukleoprotein są zastępowane przez protaminy . Podczas wymiany nukleoprotein powstaje wiele czasowo funkcjonalnych białek, które ulegają degradacji w specjalnych miejscach degradacji. Kieszenie jądrowe u podstawy głowy plemnika zostały zaproponowane jako centra proteolityczne i miejsce wyjścia, z którego pozostałości białkowe opuszczają jądro i mogą być funkcjonalnie połączone z wakuolami .

wakuole głowy spermy są interesującym, ale słabo poznanym parametrem jakości nasienia i męskiej płodności, które wydają się być związane z wynikiem zapłodnienia in vitro u mężczyzn z upośledzoną jakością nasienia . Pochodzenie i dynamika wakuoli głowy plemników nie są dobrze poznane, a ich rola w funkcjonowaniu plemników jest dyskusyjna. Niektórzy autorzy sugerują, że wakuole plemników są normalnymi cechami głowy plemnika, podczas gdy inni opisują je jako struktury zwyrodnieniowe związane z subfertility męskiej . W związku z tym celem pracy była ocena udziału procentowego plemników z wakuolami głowy zarówno w próbkach zdrowych plemników, jak i w próbkach o zaburzonej morfologii plemników oraz powiązanie ich z wynikiem zapłodnienia in vitro. Ponadto, ultrastruktura i funkcja wakuoli głowy plemnika zostały ponownie rozpatrzone w odniesieniu do dojrzewania plemników, przy użyciu wysokiej rozdzielczości transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

2. Materiały i metody

w badaniu tym zbadano próbki nasienia 81 mężczyzn włączonych do programu zapłodnienia in vitro: 40 mężczyzn z prawidłową morfologią plemników i 41 mężczyzn z nieprawidłową morfologią plemników (teratozoospermia) zgodnie ze ścisłymi kryteriami Krugera (nieprawidłowe: < 14% prawidłowych plemników). Próbki nasienia zostały przygotowane i wykorzystane do zapłodnienia in vitro. Każdą próbkę nasienia przygotowano przez odwirowanie (300 g) przez 20 minut na gradiencie gęstości 100%/40% bielma (NidaCon, Szwecja), a następnie techniką swim-up, w której z próbki wyekstrahowano najlepsze plemniki. Wszystkie normalne próbki nasienia wykorzystano do klasycznego zapłodnienia in vitro (IVF), natomiast próbki o nieprawidłowej morfologii plemników wykorzystano do intracytoplasmic sperm injection (ICSI) w celu zapłodnienia oocytów partnerki. Próbki, które pozostały po zapłodnieniu in vitro, wykorzystano do badania morfologii organelle plemników (MSOME) w celu oceny odsetka wakuoli głowy plemników w każdej próbce w powiększeniu 6000-krotnym. Porównano udział procentowy plemników z wakuolami głowy i wynik zapłodnienia in vitro pomiędzy normalnymi i nieprawidłowymi próbkami plemników. Przy użyciu wysokiej rozdzielczości transmisyjnej mikroskopii elektronowej (tem) obserwowano ultrastrukturę 10 próbek mężczyzn normozoospermicznych i 6 próbek mężczyzn teratozoospermicznych. Zbadano potencjalną funkcję i strukturę wakuoli, również w odniesieniu do procesu dojrzewania plemników.

to badanie zostało zatwierdzone przez Krajową Komisję Etyki medycznej.

2.1. Klasyczne Parametry jakości nasienia

oceniano Klasyczne parametry, stężenie i ruchliwość plemników oraz morfologię każdej próbki nasienia. Próbka plemników miała być prawidłowa przy stężeniu ≥15 milionów plemników na mL i ≥40% wszystkich (postępujących i nieprogresywnych) plemników ruchliwych zgodnie z kryteriami WHO oraz przy ≥14% morfologicznie prawidłowych plemników zgodnie ze ścisłymi kryteriami Krugera.

2.2. Badanie morfologii Organelle plemnika ruchliwego (MSOME)

do badania morfologii organelle plemnika ruchliwego użyliśmy kropelek pożywki nasiennej (Origio, dania) w naczyniu ze szklanym dnem (GWSt1000; Will Co, Wells, Amsterdam, Holandia) i kropelki próbki nasienia przygotowane techniką swim-up, wcześniej opisaną przez Knez . Plemniki w każdej próbce były monitorowane pod mikroskopem odwróconym z podgrzewanym stopniem wyposażonym w różniczkowy kontrast interferencyjny (Eclipse TE2000-s; Nikon, Japonia). Jedna cienka, Wydłużona kropla środka nasiennego (Origio, Dania) została umieszczona na dnie szklanego naczynia. Mniejsza kropla przygotowanych plemników została umieszczona w pobliżu kropli plemników i plemników związanych z hialuronianem. Wszystkie kropelki zostały pokryte olejem parafinowym, aby zapobiec wysuszeniu próbki nasienia. W celu obserwacji przy powiększeniu 6000 pod szklanym naczyniem (pod kroplą Spermslowa) wstawiono kroplę oleju zanurzeniowego. Kropla spermy z wiązaniem plemników była monitorowana przez obiektyw zanurzeniowy, kontrast zakłóceń różnicowych i Aparat Cyfrowy Nikon DS-Ri1. W każdej próbce wybrano 200 plemników związanych z hialuronianem i oceniono je według wakuoli głowy, przy 6000-krotnym powiększeniu. System punktacji dla oceny poszczególnych plemników opierał się na następującej klasyfikacji Vanderzwalmen . W zależności od liczby wakuoli i ich wielkości plemniki zostały sklasyfikowane w następujący sposób: klasa I: brak wakuoli, Klasa II: maksymalnie dwa małe wakuole, Klasa III: więcej niż dwa małe wakuole lub co najmniej jeden duży wakuol i klasa IV: Duże wakuole w połączeniu z nieprawidłowym kształtem głowy lub innymi nieprawidłowościami. W każdej próbce nasienia oceniano proporcje plemników klasy I, klasy II, klasy III i klasy IV. Dla celów statystycznych proporcje plemników klasy I I klasy II połączono w jedną grupę „dobrego nasienia”, a proporcje plemników klasy III i klasy IV w jedną grupę” złego nasienia ” w trzech kategoriach wakuoli głowy plemników.

2.3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (tem)

aby opisać ultrastrukturalną charakterystykę wakuoli w jądrze nasienia, wybrane próbki plemników wirowano w temperaturze 500 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Supernatanty ostrożnie usuwano i granulki utrwalano w 2,5% aldehydu glutarowego i 1% paraformaldehydu w 0.1 M PB (bufor fosforanowy Sörensena), pH 7,0 przez 24 h W 4°C, postfiksowany 1% OsO4 w 0,1 m Pb przez 1,5 h i osadzony w żywicy Agar 100 (Agar Scientific). Ultracienkie odcinki zabarwiono 4% roztworem wodnym octanu uranylu i cytrynianu ołowiu Reynoldsa. Próbki zbadano mikroskopem elektronowym Philips CM 100 (Fei, Holandia), pracującym przy napięciu 80 kV; obrazy zarejestrowano kamerą Bioscan 792 i Orius 200 (Gatan) przy użyciu cyfrowego oprogramowania Mikrograph (Gatan Inc., Waszyngton, DC, USA) w powiększeniach od 1100 do 92000 razy.

2.4. Analiza statystyczna

istotność statystyczna różnic w odsetku plemników z wakuolami głowy plemników oraz wynik zapłodnienia in vitro (wskaźnik ciąży) między normalnymi próbkami nasienia a próbkami o nieprawidłowej morfologii (teratozoospermia) oceniano za pomocą testu chi-kwadrat. Odsetek ” dobrych plemników „(Klasa I i klasa II),” złych plemników ” (klasa III i klasa IV) oraz plemników klasy I, klasy II, klasy III i klasy IV pod względem wakuoli głowy plemników był skorelowany z klasycznymi parametrami jakości nasienia (stężenie, ruchliwość i morfologia), czynnikami męskimi (objętość nasienia, leukocytospermia, wiek, wzrost, waga i wskaźnik masy ciała) oraz wynikiem zapłodnienia in vitro (zapłodnienie, blastocysty i wskaźniki ciąży) przy użyciu korelacji Rho Spearmana. W odniesieniu do wyników zapłodnienia in vitro, dane zostały ocenione dla całkowitych cykli zapłodnienia in vitro oraz oddzielnie dla klasycznego zapłodnienia in vitro (IVF) i intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Zależność ciąży od czynników kobiecych i męskich (w tym wakuoli głowy plemników) oceniano na podstawie wielowymiarowej regresji logistycznej. Istotność statystyczna została ustalona na

3. Wyniki i dyskusja

3.1. Badanie morfologii Organelle plemników ruchliwych (MSOME)

3.1.1. Wakuole głowy spermy jak widać w mikroskopie świetlnym MSOME

w obu, normalnych i nieprawidłowych próbkach plemników, wakuole znajdowały się w różnych częściach głowy plemników. Postrzegano je jako wklęsłości powierzchniowe lub jaśniejsze przezroczyste obszary o różnych rozmiarach i liczbach. W literaturze wakuole głowy plemnika są opisywane jako wklęsłości powierzchniowe, kieszonkowe wklęsłości jądrowe lub jądrowe odciski kciuka pod mikroskopem świetlnym. W naszym badaniu MSOME, przy użyciu mikroskopii Nomarskiego DIC w powiększeniu 6000-krotnym, wykazało wakuole głowy plemnika jako wklęsłości powierzchniowe (ryc. 1). Należy jednak wziąć pod uwagę, że mikroskopia Nomarskiego DIC daje obraz pseudo-3D z powodu załamania światła przechodzącego przez próbkę o różnej grubości i gęstości optycznej. Dlatego możliwe jest, że regiony jądrowe o różnej gęstości optycznej to nie tylko wklęsłości, ale także nieregularne wybrzuszenia na powierzchni komórki.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Rysunek 1

plemniki z wakuolami głowy w próbkach normozoospermicznych ((A), (c) i (e)) i teratozoospermicznych ((b), (d) i (f)) z mikroskopem DIC (Nomarski) przy 6000-krotnym powiększeniu.

3.1.2. Wakuole głowy spermy, Klasyczne Parametry jakości nasienia i czynniki męskie

nasze dane pokazują, że wakuole głowy spermy były obecne zarówno w normalnych, jak i nieprawidłowych próbkach nasienia (ryc. 1). Co ciekawe, odnotowano stosunkowo wysoki odsetek (74,6%) plemników z wakuolami główki spermy w plemnikach o normalnej jakości, co wskazuje, że wakuole główki spermy występują również u mężczyzn normospermicznych (Tabela 1). Chociaż u mężczyzn z teratozoospermią stwierdzono wyższy odsetek plemników z wakuolami głowy niż u mężczyzn z normalną jakością nasienia (90,2% w porównaniu z 74,6%), jak widać w tabeli 1, nie wyklucza się, że wakuole głowy plemników mogą być również związane z patologią plemników u tych mężczyzn. Ponadto u mężczyzn z teratozoospermią stwierdzono znacznie niższy odsetek optymalnych plemników klasy I oraz wyższy odsetek plemników niskiej jakości klasy III I IV niż w próbkach normalnych plemników (Tabela 1)

jednak niektóre wcześniejsze badania wykazały wyższy odsetek wakuolowanych plemników u mężczyzn z normalnymi parametrami nasienia, wynoszący od 97,7% do 98,4% . Ta rozbieżność odzwierciedla fakt, że subfertile mężczyźni z normalną jakością nasienia, ale włączeni do programu zapłodnienia in vitro reprezentują heterogeniczną populację mężczyzn, od płodnych partnerów niepłodnych kobiet do mężczyzn z powtarzającym się słabym wynikiem zapłodnienia in vitro pomimo normalnej jakości nasienia. Ponadto, istnieje kilka różnych nawyków, styl życia, i warunki zdrowotne (na przykład, zapalenie i żylaki powrózka nasiennego), które mogą wpływać na ich plemniki pod względem wakuoli głowy. Stwierdzono dodatnią korelację między odsetkiem „dobrego nasienia” (Klasa I i klasa II) pod względem wakuoli głowy oraz stężenia plemników i morfologii plemników (procent normalnego nasienia) u mężczyzn włączonych do tego badania, co widać w tabeli 2.

Ponadto stwierdzono dodatnią korelację między proporcją plemników klasy I a ich stężeniem, ruchliwością i morfologią. Z drugiej strony stwierdzono ujemną korelację pomiędzy odsetkiem „złych plemników” (Klasa III i klasa IV) pod względem wakuoli głowy oraz stężenia i morfologii plemników (Tabela 2). Ponadto odsetek plemników klasy III I IV był ujemnie skorelowany z morfologią plemników, a odsetek plemników klasy IV był również ujemnie skorelowany z ruchliwością plemników. Wszystkie te dane wskazują, że wakuole głowy plemników były związane z zaburzeniami jakości plemników, chociaż były również obecne w normalnych próbkach plemników. To odkrycie jest zgodne z niektórymi wcześniejszymi badaniami .

co ciekawe, istniała znacząca ujemna korelacja między wiekiem mężczyzny a stężeniem nasienia, podczas gdy nie zaobserwowaliśmy żadnej korelacji między wakuolami głowy spermy a czynnikami męskimi, takimi jak wiek, wzrost, waga i wskaźnik masy ciała (Tabela 3).

nie znaleźliśmy również istotnej korelacji między objętością nasienia lub leukocytospermią a wakuolami głowy plemników. Z drugiej strony, było więcej wcześniejszych badań, które wykazały, że niektóre z tych męskich czynników mogą mieć wpływ na jakość plemników i tworzenie wakuoli głowy . Jedno z tych badań wykazało, że zwiększony wiek mężczyzn i wskaźnik masy ciała są związane ze zwiększeniem wakuoli głowy spermy, ale może to być kompensowane przez wyższą częstotliwość wytrysku i krótszy okres abstynencji seksualnej u tych mężczyzn . Oznacza to, że niektóre inne wciąż nieznane czynniki męskie wpływają na wygląd wakuoli głowy spermy.

3.1.3. Wakuole głowy plemników i wynik zapłodnienia in Vitro

grupy mężczyzn włączone do badania nie różniły się pod względem średniego wieku partnerek i liczby oocytów na kobietę, głównych żeńskich czynników, które mogą mieć wpływ na wynik zapłodnienia in vitro (Tabela 4). Częstość występowania ciąży u mężczyzn z teratozoospermią i normozoospermią wynosiła 32, 5% i 26, 8% (patrz Tabela 4).

w wyniku dalszej kontroli okazało się, że proporcja „dobrych plemników” lub „złych plemników” pod względem wakuoli głowy w próbkach nasienia była wskaźnikiem proporcji zapłodnionych oocytów (szybkość zapłodnienia) po procedurze zapłodnienia in vitro, ale zależało to od metody zapłodnienia in vitro. Po klasycznym zapłodnieniu in vitro (IVF) stwierdzono istotną dodatnią korelację między odsetkiem „dobrego nasienia” w próbce nasienia a wskaźnikiem zapłodnienia (Tabela 5). Z drugiej strony, stwierdzono ujemną korelację między odsetkiem „złych plemników” a wskaźnikiem zapłodnienia, co widać w tabeli 5.

na rysunku 2 widać, że w próbkach nasienia z więcej niż ~50% „złych plemników” pod względem wakuoli głowy spermy, szybkość zapłodnienia została zmniejszona. Co ciekawe, nie zaobserwowaliśmy żadnej korelacji między wakuolami głowy plemników a wskaźnikiem zapłodnienia po wstrzyknięciu intracytoplasmic injection (ICSI), jak stwierdzono w niektórych wcześniejszych badaniach . Oznacza to, że wakuole głowy plemnika mogą upośledzać niektóre fizjologiczne procesy plemników, które są potrzebne do klasycznego zapłodnienia in vitro przez inseminację, takie jak kondensacja, reakcja akrosomowa, Wiązanie plemników z zona pellucida lub że większa selekcja plemników jest wykonywana przez ICSI.

Rysunek 2

zależność pomiędzy wakuolami głowy plemnika (proporcja złych plemników: Klasa II plus Klasa III) w próbkach nasienia a wskaźnikiem zapłodnienia oocytów po klasycznym zapłodnieniu in vitro (IVF).

jeśli chodzi o wskaźnik blastocysty, stwierdzono ujemną korelację () pomiędzy odsetkiem plemników klasy III w próbkach nasienia a wskaźnikiem blastocysty po klasycznym zapłodnieniu in vitro, podczas gdy nie zaobserwowano żadnych innych korelacji. Bez względu na metodę zapłodnienia in vitro nie zaobserwowaliśmy korelacji pomiędzy wakuolami głowy plemników a częstością ciąży. Stwierdzono dodatni związek między ciążą a liczbą komórek jajowych pobranych u partnerki, co ujawnił test Manna-Whitneya, ale nie znaleźliśmy żadnego związku między ciążą a wakuolami głowy plemników. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez wielowymiarową regresję logistyczną dotyczącą czynników kobiecych i męskich, w tym wakuoli głowy spermy.

większość poprzednich badań starała się wyjaśnić wpływ wakuoli głowy plemników na wynik ICSI u mężczyzn o złej jakości nasienia, a niektóre z nich rzeczywiście potwierdziły negatywny wpływ . Zaletą naszych badań jest to, że wyjaśniliśmy wpływ wakuoli głowy plemników nie tylko na wynik ICSI w próbkach nasienia złej jakości (teratozoospermia), ale także na wynik klasycznego IVF w normalnych próbkach nasienia (z normalnymi klasycznymi parametrami jakości nasienia, w tym morfologią). Nasze dane wskazują, że wakuole głowy spermy były jeszcze bardziej szkodliwe dla wyniku klasycznego IVF niż ICSI.

3.2. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (tem)

podobnie, jak w przypadku MSOME, transmisyjna mikroskopia elektronowa (tem) ujawniła wakuole głowy plemnika w normalnych i nieprawidłowych próbkach nasienia. Wakuole w głowach plemników były postrzegane jako jaśniejsze obszary wewnątrz jądra i były obecne w prawie wszystkich plemnikach w obu typach próbek plemników(Fig. 3 (A) i 3 (b)). Mikroskopy elektronowe wakuoli głowy plemników są rzadko przedstawiane w literaturze, a interpretacja ich ultrastruktury jest rzadka . Opis drobnej struktury plemników ludzkich zwykle przedstawia Duże lucent obszary w głowach plemników jako wakuole i mniejsze jasne obszary jako nukleoplazma lub jasne plamy .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Rysunek 3

Transmission electron micrographs (TEM) of normozoospermic samples with head wakuoles of different size and position. Strzałka wskazuje wakuole na (b), (c) i RNE na (d). A: akrosom, N: jądro, m: mitochondria i RNE: zbędna koperta jądrowa.

w przeciwieństwie do mikroskopów lekkich, w których wakuole są postrzegane jako wklęsłości powierzchniowe, w mikroskopach elektronowych, wakuole były sporadycznie obserwowane jako wybrzuszenia na powierzchni komórki (Fig.3(c)). Ze względu na różną gęstość optyczną wakuoli i skondensowaną chromatynę, wgniecenia jądrowe wypełnione błonami pojawiają się jako wklęsłości powierzchniowe pod mikroskopem świetlnym.

3.2.1. Cechy ultrastrukturalne wakuoli głowy plemnika

mikroskopy elektronowe wakuoli głowy plemnika wykazały wgniecenia jądrowe zawierające stosy błon (Fig. 4(C), 4 (d) i 4(f)). Błony te zostały zorganizowane jako koncentrycznie ułożone lamele i są opisane jako błony whorls (MW), które czasami wybrzuszają się z powierzchni komórki. Błony o różnej złożoności były obecne w różnych obszarach jądra plemnika i mogą zajmować duży obszar jądra zarówno w morfologicznie normalnych, jak i nieprawidłowych plemnikach. W prawie wszystkich przypadkach, obwódki błonowe były pokryte nienaruszonym akrosomem i błoną plazmatyczną(Fig. 4(C) i 4 (d)). Składały się one głównie z ciasno upakowanych podwójnych membran z gęstą elektronowo przegrodą molekularną i cieńszych membran otaczających materiał flokularny (Fig.4(d) i 4(f)). Franklin i Fussell obserwowali szczeliny błonowe w podakrosomalnej przestrzeni apical późnych plemników chomika, które były ciągłe z otoczką jądrową. Według autorów, błona nabłonkowa okazała się większa i występowała w większej liczbie w końcowej lub dojrzewającej fazie spermiogenezy.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Rysunek 4

TEM. teratozoospermia (A), (c), (d), (e) i (f)) oraz teratozoospermia (b). a) wgniecenia jądrowe z membranami otaczającymi materiał flokulacyjny (gwiazdka). Podwójna membrana z przegrodą molekularną (strzałką) wyłaniającą się z koperty jądrowej. (b) jądro z wyraźnymi Plamami chromatyny nieskondensowanej (strzałka) i dużym obszarem z materiałem flokulacyjnym (gwiazdka). c) membrany (MW) składające się ze współśrodkowo ułożonych membran. (d) Duże Powiększenie błony bębenkowej (c). (e) błony (MW) zajmujące dużą część jądra. f) Duże Powiększenie podwójnych błon z kompleksami przegrodowymi (strzałka) i cienkimi błonami (strzałka). A: akrosom; N: jądro.

dojrzewanie plemników prowadzi do reorganizacji jądra i zmniejszenia jego wielkości. Z literatury wiadomo, że dojrzewanie jądrowe wiąże się z redukcją koperty jądrowej, dynamicznej podwójnej błony, która otacza jądro, segreguje chromosomy i reguluje transport jądrowy przez pory . Wiele szczegółów jego transformacji jest nadal niejasnych. Nasze mikrografy błon szkieletowych wykazały ciągłość błon z otoczką jądrową(ryc. 5 (A) i 5(c)). Struktury membranowe z przegrodowymi elektronowymi kompleksami molekularnymi powstają prawdopodobnie podczas reorganizacji koperty jądrowej. Struktury te zostały opisane przez kilku autorów jako zbędna koperta jądrowa (RNE) . RNE jest widoczne w naszym mikrografie normalnych plemników (ryc. 3 (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Rysunek 5

przekroje plemników w próbkach normozoospermicznych ((A), (b) i (c)) z dużymi wcięciami jądrowymi z przekrojami membranowymi (MW). Błona akrosomowa jest połączona z otoczką jądrową (strzałkami). c) membrany (MW) z dodatkowymi membranami między jądrem a akrosomem (arrowhead). D) duża część chromatyny nieskondensowanej z tworzeniem ziarnistym wewnątrz jądra (strzałki) plemników o nieprawidłowej morfologii. A: akrosom, N: jądro i C: cytoplazma.

różne etapy kondensacji chromatyny są widoczne w naszych mikroskopach we wszystkich próbkach. Na fig. 5 (d) widzimy jeden plemnik o nieprawidłowej morfologii w procesie kondensacji chromatyny, który nadal jest otoczony dużą ilością cytoplazmy. W późnej spermatogenezie DNA plemników staje się szczelnie upakowane, ponieważ histony są zastępowane przez protaminy . Jednak często występują defekty kondensacyjne, w wyniku których w jądrze powstają nieregularnie ukształtowane, przezroczyste przestrzenie o różnych rozmiarach . Wiadomo, że awaria kondensacji chromatyny wiąże się z obecnością małych i dużych wakuoli . Nasze mikrografy ujawniły mniejsze obszary lucent elektronowych chromatyny i wakuoli jądrowych, które różnią się wielkością i zawsze zawierają materiał amorficzny lub/i błony. Mogą być bardziej wyrażone w plemnikach próbek teratozoospermicznych i mogą być związane z nieprawidłowym procesem dojrzewania plemników i wakuolami głowy plemników. Konieczne są jednak bardziej ukierunkowane badania.

akrosom był w pełni rozwinięty u większości plemników z wakuolami głowy plemnika. W niektórych komórkach zaobserwowano wzajemne połączenia wewnętrznej błony akrosomalnej i otoczki jądrowej(Fig. 5(A) i 5 (b)). Morfogeneza akrosomu jest procesem dynamicznym, który obejmuje ścisłą interakcję między kompleksem Golgiego a otoczką jądrową wczesnej spermatydy. Wykazano, że nadjądrzaste theca (PT) jest strukturą cytoszkieletu, która obejmuje jądro plemników u ssaków i wykazano, że odgrywa ważną rolę w prawidłowym tworzeniu akrosomów .

w opinii Settiego i wsp. , niektórzy autorzy donoszą, że wakuole plemników są pochodzenia akrosomalnego i odzwierciedlają nieodwracalny akrosom . Ujawnia się negatywny związek między obecnością wakuoli a zdolnością plemników do poddania się reakcji akrosomalnej. Nasze dane pokazują, że wakuole głowy plemnika są unikalnymi strukturami, Zwykle pokrytymi nienaruszonym akrosomem.

nieprawidłowe plemniki były obecne w obu typach próbek plemników-normalnych i nieprawidłowych. Nieprawidłowości dotyczyły różnych składników plemników, a mianowicie chromatyny, akrosomu, regionu szyi, mitochondriów i ogona. Przedstawiamy kilka mikrografów nieprawidłowych plemników z próbek normozoospermicznych z mniej skondensowaną chromatyną, zgiętą szyją, nietypowym akrosomem i nieprawidłowym kształtem głowy (Rysunek 6).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Rysunek 6

(A), b), c) I d) plemniki z normalnych próbek plemników o nieprawidłowej morfologii. Chromatyna jest ziarnista i mniej skondensowana z licznymi wyraźnymi plamkami (białe strzałki). Akrosom jest nieprawidłowo utworzony (a), częściowo utworzony (d), a czasami połączony z błonami (b). c) zgięty region szyi. A: akrosom; N: jądro.

3.2.2. Funkcja wakuoli głowy spermy

obecnie niemożliwe jest określenie rzeczywistej funkcji wakuoli głowy spermy. Opierając się na naszych mikrografach ultrastruktury plemników, sugerujemy, że wakuole głowy plemnika mogą usuwać pewną substancję nieznanego pochodzenia z chromatyny. Ponieważ wskazują one na potencjalny związek zarówno z procesem dojrzewania plemników po jednej stronie, jak i nieprawidłową kondensacją chromatyny po drugiej stronie, można spekulować, że wakuole głowy plemnika mogą być zaangażowane w usuwanie histonów po zastąpieniu ich protaminami. Jest jednak za wcześnie na jakiekolwiek wnioski i potrzebne są dalsze badania.

4. Wnioski

wyniki tego badania wskazują, że próbki plemników mężczyzn z teratozoospermią charakteryzują się zwiększonym stosunkiem wakuoli głowy plemników, chociaż są one obecne również w próbkach plemników mężczyzn z normospermą. Oznacza to, że mogą one być związane ze stanem patologicznym. Nasze mikrografy na ultrastrukturze plemników wskazują, że wakuole głowy plemnika składają się z błony bębenkowej. Różnice w kondensacji chromatyny obserwowano głównie w nieprawidłowych próbkach plemników i nie jest wykluczone, że są one związane z nieprawidłowym dojrzewaniem i wakuolami głowy plemników. Potrzebne są dalsze badania łączące różne metody i transmisyjną mikroskopię elektronową, aby lepiej wyjaśnić to zjawisko.

konflikt interesów

autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszego artykułu.

podziękowania

autorzy pragną podziękować embriologom klinicznym laboratorium IVF Lab Ljubljana, Department of Obstetrics and Gynecology, University Medical Centre Ljubljana, za przygotowanie nasienia i laboratorium do mikroskopii elektronowej Wydziału Biologii, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana.