az in Vitro megtermékenyítési programban részt vevő férfiak Spermafej-Vakuoláinak klinikai és szerkezeti jellemzői

absztrakt

az emberi spermafej-vakuolák és szerepük a férfiak meddőségében még mindig kevéssé ismertek. A vizsgálat célja az volt, hogy azonosítsa a humán spermium fej vakuoláinak klinikai és ultrastrukturális jellemzőit az in vitro megtermékenyítési programban részt vevő férfiaknál: normál (normozoospermia) és károsodott spermium morfológiájú (teratozoospermia) férfiaknál. A spermiummintákat 6000-szeres nagyítás alatt figyelték meg motile spermium organelle morfológiai vizsgálat (MSOME) alkalmazásával. A fej vakuolákkal rendelkező spermiumok arányát az in vitro megtermékenyítés eredményével összefüggésben értékelték. A károsodott spermamorfológiájú férfiak spermáját a spermafej-vakuolok nagyobb aránya jellemezte. A spermium fej vakuolái kapcsolatban álltak a sperma minőségének romlásával (spermakoncentráció, motilitás és morfológia), de nem befolyásolták őket a férfi tényezők (spermamennyiség, magasság, életkor, súly vagy testtömeg-index). Sőt, a spermafej vakuolái csak a klasszikus után kapcsolódtak a károsodott megtermékenyítési arányhoz in vitro megtermékenyítés (IVF), míg nem volt kapcsolat a terhességgel. A férfiak egy alcsoportjában a spermiumot rögzítették és transzmissziós elektronmikroszkóppal (tem) figyelték meg. Az ultrastrukturális vizsgálat kimutatta, hogy a spermiumfej vakuolái különböző méretű és helyzetű nagy maghézagok, amelyek membrán örvényekbe (MW) szervezett membrános anyaggal vannak tele.

1. Bevezetés

a férfi meddőség összefügghet a spermiumok rendellenes morfológiájával. Az elmúlt években sok vita folyt a spermiumminőség és a férfi termékenység új lehetséges paraméteréről, a spermiumfej vakuoláiról. Annak ellenére, hogy az emberi sperma fej vakuolák és a potenciális szerepe a férfi meddőség még mindig rosszul ismert.

mozgó spermium organelle morfológiai vizsgálat (MSOME) alkalmazásával, ahol az élő spermiumsejteket DIC Nomarski mikroszkóppal 6000-szeres nagyítással vizualizálják, néhány finom morfológiai szerkezet látható, amelyek hasznosak lehetnek a sperma minőségének meghatározásához. Ez a módszer azt mutatja, a kis és nagyobb felületi konkáv úgynevezett spermium vakuolák, általában található a fejét a sperma sejtek. A spermium fej vakuoláinak jellege és eredete még mindig bizonytalan, és nem világos, hogy a magból vagy az akroszómából vagy más hártyás struktúrákból származnak-e. A vakuolák szinte minden normál spermamorfológiájú mintában megtalálhatók (> 14% morfológiailag normális spermiumok Kruger szigorú kritériumai szerint), és főleg a spermafejek csúcsán vagy középső részén helyezkednek el . A háromdimenziós dekonvolúciós képek, amelyek detektálják a DNS-t, a vakuolákat “nukleáris konkávként” mutatták, az atomerő mikroszkópia pedig ép, de kissé elsüllyedt plazmamembránt mutatott ki a vakuolák területén . Ezenkívül a spermaminták elektronmikroszkópos képei abnormális spermamorfológiában szenvedő betegeknél, teratozoospermia (<14% normál spermiumok a mintában Kruger szigorú kritériumai szerint), vakuolákat mutattak kizárólag a spermamag területén . A spermiumfej vakuolák elülső elhelyezkedése felvetette a kérdést az akroszómából való lehetséges eredetükről. Az a23587 ionofor , follikuláris folyadék és hialuronsav által kiváltott akroszóma reakció csökkentette a fej vakuolákkal rendelkező spermiumok százalékos arányát, ami azt sugallta, hogy ezek kapcsolatban állhatnak az akroszómával. A vacuolák azonban akroszóma (azaz globozoospermia) nélküli spermamintákban is jelen vannak, ami arra utal, hogy nem akroszómából származnak . Kimutatták, hogy a nagy spermiumfejű vakuolákkal (a fej felületének több mint 13% – A) rendelkező minták nagyobb százalékban fragmentált DNS-t tartalmaznak, mint a kis vakuolákkal rendelkezők, valamint a kromoszóma-rendellenességek nagyobb gyakorisága . A fénymikroszkópia nagy nagyításánál megfigyelt spermafej-vakuolákat “zsebszerű” nukleáris konkávoknak nevezték, amelyek a kromatin kondenzáció meghibásodásával kapcsolatosak . Éppen ellenkezőleg, egyes kutatók nem találtak összefüggést a nagy spermiumfej vakuolák és a DNS-károsodás vagy a kromoszóma-rendellenességek között . A spermiummag modellezése a spermiogenezis során magában foglalja a nukleoproteineket, a mikrotubuláris mandzsettát és a perinukleáris anyagot, amelyről ismert, hogy részt vesz a mag akroszómájának rögzítésében, és a perinukleáris thecát is alkotja . A spermiogenezis során a mag feltűnően redukálódik, és a nukleoszómák általában véletlenszerűen eloszlanak a genomban. A nukleoszómához kötött DNS a magmátrixtal együtt maradhat, és az elektronikus képeken “üres térnek” tekinthető. Együtt fontos szerepet játszhatnak az apai kromatin szerkezetben a megtermékenyítést követően . A spermiogenezis késői lépéseiben a nukleáris DNS erősen kondenzálódik, mivel a nukleoproteinek hisztonjait protaminok helyettesítik . A nukleoproteinek cseréje során számos átmenetileg funkcionális fehérje képződik és lebomlik speciális lebomlási helyeken. Azt javasolták, hogy a spermiumfej tövében lévő magzsebek proteolitikus központokként működjenek, és a kilépési hely, ahonnan a fehérjemaradványok elhagyják a magot, és funkcionálisan kapcsolódhatnak a vakuolákhoz .

a spermiumfej vakuolái érdekes, de kevéssé ismert paraméterei a spermiumminőségnek és a férfi termékenységnek, amelyek úgy tűnik, hogy összefüggenek az in vitro megtermékenyítés eredményével a károsodott spermiumminőségű férfiaknál . A spermium fej vacuolák eredete és dinamikája nem jól ismert, és a spermium működésében betöltött szerepük vitatható. Egyes szerzők azt sugallják, hogy a spermium vacuolák a spermium fejének normális jellemzői, míg mások a férfi szubfertilitáshoz kapcsolódó degeneratív struktúrákként írják le őket . Ezért ennek a tanulmánynak az volt a célja, hogy értékelje a fej vakuolákkal rendelkező spermiumok százalékos arányát mind a normál spermamintákban, mind a károsodott spermamorfológiájú mintákban, és összekapcsolja őket az in vitro megtermékenyítés eredményével. Ezen túlmenően a spermium fej vakuoláinak ultrastruktúráját és működését a spermium érésével kapcsolatban felülvizsgálták, a transzmissziós elektronmikroszkópia nagy felbontásával.

2. Anyagok és módszerek

ebben a vizsgálatban az in vitro megtermékenyítési programba bevont 81 férfi spermamintáit vizsgálták: 40 férfi normál spermamorfológiával és 41 férfi rendellenes spermamorfológiával (teratozoospermia) Kruger szigorú kritériumai szerint (kóros: < 14% normál sperma). A spermamintákat in vitro megtermékenyítésre készítették és használták. Mindegyik spermamintát centrifugálással (300 g) állítottuk elő 20 percig 100%/40% sűrűséggradiensen a Purespermen (NidaCon, Svédország), majd úszási technikával, ahol a legjobb spermiumokat kivontuk a mintából. Az összes normál spermamintát klasszikus in vitro megtermékenyítéshez (IVF), míg a rendellenes spermamorfológiájú mintákat intracitoplazmatikus spermium injekcióhoz (ICSI) használták a női partner petesejtjeinek megtermékenyítésére. Az in vitro megtermékenyítés után megmaradt mintákat mozgékony spermium organelle morfológiai vizsgálathoz (MSOME) használták a spermium fej vakuolák százalékos arányának értékelésére minden mintában 6000-szeres nagyítás alatt. A fejvakuolákkal rendelkező spermiumok százalékos arányát és az in vitro megtermékenyítés eredményét összehasonlították a normál és az abnormális spermaminták között. A transzmissziós elektronmikroszkópia (tem) nagy felbontású alkalmazásával 10 normozoospermikus férfi és 6 teratozoospermikus férfi minta ultrastruktúráját figyelték meg. Megvizsgáltuk a vakuolák lehetséges működését és szerkezetét, a spermiumok érési folyamatával kapcsolatban is.

ezt a kutatást az Országos Orvosi Etikai Bizottság hagyta jóvá.

2.1. A sperma minőségének klasszikus paraméterei

az egyes spermaminták klasszikus paramétereit, spermakoncentrációját, motilitását és morfológiáját értékelték. A spermamintának normálisnak kellett lennie 15 millió ml / ml koncentrációban és a WHO kritériumai szerint az összes (progresszív és nem progresszív) mozgékony spermium 40% – ánál, Kruger szigorú kritériumai szerint pedig a morfológiailag normális spermiumok 14% – ánál.

2.2. Motile spermium Organelle morfológiai vizsgálat (MSOME)

a motile spermium organelle morfológiai vizsgálatához SpermSlow közepes cseppeket (Origio, Dánia) használtunk egy üveg fenekű edényben (GWSt1000; Will Co, Wells, Amszterdam, Hollandia) és a Knez által korábban leírt swim-up technikával készített spermaminta cseppjei . Az egyes mintákban lévő spermatozoidokat fordított mikroszkóp alatt figyelték meg, differenciális interferencia kontraszttal felszerelt fűtött fokozattal (Eclipse TE2000-S; Nikon, Japán). Egy vékony, hosszúkás csepp Spermalassú táptalajt (Origio, Dánia) helyeztünk egy üvegedény aljára. Az elkészített spermiumok kisebb cseppjét a spermiumok közelében helyeztüklassú csepp és a hialuronáthoz kötött spermiumok. Az összes cseppet paraffinolajjal borítottuk, hogy megakadályozzuk a spermaminta kiszáradását. A 6000 nagyítás alatti megfigyeléshez egy csepp merülő olajat helyeztünk az üvegedény alá (a SpermSlow csepp alá). Egy csepp spermalassú, kötött spermatozoidot figyeltünk meg az immersion objektívvel, a differenciális interferencia kontraszttal és egy Nikon Digital Sight DS-Ri1 kamerával. Minden mintában 200, a hialuronáthoz kötött spermatozoidot választottak ki és értékeltek fej vakuolák szerint, 6000-szeres nagyítással. Az egyes spermiumok értékelésének pontozási rendszere a Vanderzwalmen következő osztályozásán alapult . A vakuolák száma és mérete alapján a spermiumokat a következő osztályokba sorolták: I. osztály: vakuolák hiánya, II. osztály: legfeljebb két kis vakuol, III. osztály: kettőnél több kis vakuol vagy legalább egy nagy vakuol, és IV.osztály: nagy vakuolák rendellenes fejformákkal vagy más rendellenességekkel együtt. Mindegyik spermamintában az I., II., III. és IV. osztályú spermiumok arányát értékelték. Osztályú spermiumok arányát egy csoportba, a “jó spermiumba”, valamint a III.és IV. osztályú spermiumok arányát egy csoportba, a “rossz spermiumba”, a spermafej vakuolák 3 szempontjából.

2.3. Transzmissziós elektronmikroszkópia (tem)

a spermiummagban lévő vacuolák ultrastrukturális jellemzőinek leírására a kiválasztott spermamintákat 500 g-on centrifugáltuk 10 percig szobahőmérsékleten. A felülúszókat óvatosan eltávolítottuk, és a pelleteket 2,5% glutáraldehidben, 1% paraformaldehidet pedig 0-ban rögzítettük.1 M PB (s Enterprensen Foszfátpuffer), pH 7,0 24 h – ra 4 6c-n, 1% OsO4-vel rögzítve 0,1 M PB-ben 1,5 h-ra, és 100 agar gyantába ágyazva (agar Tudományos). Az ultravékony részeket 4% – os uranil-acetát és Reynolds-ólom-citrát vizes oldattal festettük. A mintákat Philips CM 100 elektronmikroszkóppal (Fei, Hollandia) vizsgáltuk, 80 kV-on; a képeket Bioscan 792 és Orius 200 kamerával (Gatan) rögzítettük digitális Mikrográf, szoftver (Gatan Inc., Washington, DC, USA) A nagyítás 1100-92000 alkalommal.

2.4. Statisztikai analízis

a spermiumfejes vakuolákkal rendelkező spermiumok százalékos arányában mutatkozó különbségek statisztikai szignifikanciáját és az in vitro megtermékenyítés eredményét (terhességi arány) a normál spermaminták és a rendellenes morfológiájú (teratozoospermia) minták között khi-négyzet teszttel értékeltük. A “jó sperma” (I. és II.osztály), a “rossz sperma” (III. és IV. osztály), valamint az I., II., III. és IV. osztályú spermiumok százalékos aránya a spermafej vakuolák tekintetében korrelált a sperma minőségének klasszikus paramétereivel (koncentráció, motilitás és morfológia), a férfi tényezőkkel (spermamennyiség, leukocytospermia, életkor, magasság, súly és testtömeg-index), valamint az in vitro megtermékenyítés eredményével (megtermékenyítés, blastocysta és terhességi arányok) Spearman Rho-korrelációjával. Az in vitro megtermékenyítés eredményéhez az adatokat a teljes in vitro megtermékenyítési ciklusra, valamint a klasszikus in vitro megtermékenyítésre (IVF) és az intracitoplazmatikus spermium injekcióra (ICSI) külön értékelték. A terhesség függését a női és férfi faktoroktól (beleértve a spermium fej vakuoláit) többváltozós logisztikai regresszióval értékelték. A statisztikai szignifikancia volt beállítva .

3. Eredmények és vita

3.1. Motile spermium Organelle morfológiai vizsgálat (MSOME)

3.1.1. Spermium Fej Vakuolák az MSOME

fénymikroszkópos vizsgálata szerint mind a normál, mind az abnormális spermamintákban a vakuolák a spermatozoa fejének különböző részein helyezkedtek el. Felszíni konkávoknak vagy világosabb, áttetsző, különböző méretű és méretű területeknek tekintették őket. Az irodalomban a spermafej vakuoláit felszíni konkávoknak, zsebszerű nukleáris konkávoknak vagy nukleáris hüvelykujj-nyomatoknak nevezik a fénymikroszkóp alatt. Vizsgálatunkban az MSOME, Nomarski DIC mikroszkóppal 6000-szeres nagyítással, a spermiumfej vakuoláit felszíni konkávként mutatta (1. ábra). Figyelembe kell azonban vennünk, hogy a Nomarski DIC mikroszkópia pszeudo-3D képet eredményez a különböző vastagságú és optikai sűrűségű mintán áthaladó fénytörés miatt. Ezért lehetséges, hogy a különböző optikai sűrűségű nukleáris régiók nemcsak konkávok, hanem szabálytalan kidudorodások is a sejt felszínén.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

ábra 1

a megfigyelt normozoospermikus ((a), (c) és (e)) és teratozoospermikus ((b), (d) és (f)) mintákban fejvakuolákkal rendelkező spermiumok DIC mikroszkóppal (Nomarski) 6000-szeres nagyítással.

3.1.2. Spermium Fej Vakuolák, a spermium minőségének klasszikus paraméterei és a férfi tényezők

adataink azt mutatják, hogy a spermium fej vakuolái mind a normál, mind a rendellenes spermamintákban jelen voltak (1.ábra). Érdekes, hogy a normál minőségű spermiumokban viszonylag magas (74,6%) volt a spermiumfejű vakuolák aránya, ami azt jelzi, hogy a spermiumfej vakuolái normospermikus férfiakban is megtalálhatók (1.táblázat). Bár a teratozoospermiában szenvedő férfiaknál nagyobb volt a spermiumok aránya a fej vakuolákkal, mint a normál spermaminőségű férfiaknál (90,2%, szemben a 74,6% – kal;), amint az az 1.táblázatban látható, nem zárható ki, hogy a spermiumfej vakuolái is összefügghetnek a spermium patológiájával ezekben a férfiakban. Ezenkívül a teratozoospermiában szenvedő férfiak spermájában szignifikánsan alacsonyabb volt az I. osztályú optimális spermiumok aránya, és nagyobb volt a III. és IV. osztályú alacsony minőségű spermiumok aránya, mint a normál spermiumok mintáiban (táblázat 1)

néhány korábbi tanulmány azonban a vakuolált spermiumok magasabb százalékáról számolt be szubfertilis férfiak normál sperma paraméterekkel, 97,7% – ról 98,4% – ra . Ez az eltérés azt a tényt tükrözi, hogy a normál spermaminőségű, de az in vitro megtermékenyítési programba bevont szubtermékeny férfiak heterogén populációt képviselnek, a terméketlen nők termékeny partnereitől a férfiakig, akiknek a normál spermaminőség ellenére ismételten rossz in vitro megtermékenyítési eredményük van. Ezenkívül számos különböző szokás, életmód és egészségügyi állapot (pl. gyulladás és varicocele), amelyek befolyásolhatják spermájukat a fej vakuolák szempontjából. Pozitív korreláció volt a “jó spermiumok” (I. és II. osztály) aránya között a fej vakuolái és a spermiumok koncentrációja és morfológiája (a normál spermiumok százalékos aránya) tekintetében a vizsgálatba bevont férfiaknál, amint az a 2.táblázatban látható.

ezenkívül pozitív korreláció volt az I. osztályú Sperma aránya és a spermium koncentrációja, motilitása és morfológiája között. Másrészt negatív korreláció volt a “rossz spermiumok” (III. és IV. osztály) aránya között a fej vakuolái, valamint a spermiumok koncentrációja és morfológiája szempontjából (2.táblázat). Ezenkívül a III.és IV. osztályú spermiumok aránya negatívan korrelált a spermiumok morfológiájával, és a IV. osztályú spermiumok aránya szintén negatívan korrelált a spermiumok mozgékonyságával. Mindezek az adatok azt mutatják, hogy a spermiumfej vakuolái kapcsolatban álltak a spermium minőségének romlásával, bár normál spermamintákban is jelen voltak. Ez a megállapítás összhangban van néhány korábbi vizsgálattal .

érdekes módon szignifikáns negatív korreláció volt a férfi életkor és a sperma koncentrációja között, míg nem figyeltünk meg semmilyen összefüggést a spermium fej vakuolái és a férfi tényezők között, mint az életkor, a magasság, a súly és a testtömeg-index (3.táblázat).

Nem találtunk szignifikáns összefüggést a spermamennyiség vagy a leukocytospermia és a spermafej vakuolái között. Másrészt több korábbi tanulmány is kimutatta, hogy ezek közül a férfi tényezők közül néhány hatással lehet a sperma minőségére és a fej vacuolák kialakulására . Az egyik ilyen tanulmány kimutatta, hogy a megnövekedett férfi életkor és testtömeg-index összefügg a megnövekedett spermium fej vakuolákkal, de ezt kompenzálhatja a magasabb ejakuláció gyakorisága és a szexuális absztinencia rövidebb ideje ezekben a férfiakban . Ez azt jelenti, hogy néhány más, még ismeretlen férfi tényező befolyásolja a spermafej vacuolák megjelenését.

3.1.3. Spermium Fej Vakuolák és az In Vitro megtermékenyítés kimenetele

a vizsgálatba bevont férfiak csoportjai nem különböztek a női partnerek átlagéletkora és az egy nőre jutó petesejtek száma tekintetében, amelyek a fő női tényezők, amelyek befolyásolhatják az in vitro megtermékenyítés kimenetelét (4.táblázat). Az elért terhességi arány a teratozoospermiás és normozoospermiás férfiaknál 32,5% és 26,8% volt (lásd 4.táblázat).

további vizsgálat során világossá vált, hogy a “jó sperma” vagy a “rossz sperma” aránya a spermamintákban a fej vacuolák szempontjából indikatív volt a megtermékenyített petesejtek arányára (megtermékenyítési arány) az in vitro megtermékenyítési eljárás után, de ez az in vitro megtermékenyítés módszerétől függ. A klasszikus in vitro megtermékenyítés (IVF) után szignifikáns pozitív korreláció volt a “jó sperma” százalékos aránya a spermamintában és a megtermékenyítési arány között (5.táblázat). A másik oldalon negatív korreláció volt a “rossz sperma” aránya és a megtermékenyítési arány között, amint az az 5.táblázatban látható.

a 2. ábrából látható, hogy azokban a spermamintákban, amelyekben a spermafej vakuolái tekintetében a “rossz sperma” több mint ~50% – a van, a megtermékenyítési arány csökkent. Érdekes módon nem figyeltünk meg semmilyen összefüggést a spermium fej vakuolái és az intracitoplazmatikus injekció (ICSI) utáni megtermékenyítési arány között, amint azt néhány korábbi tanulmány megállapította . Ez azt jelzi, hogy a spermafej vakuolái károsíthatják a spermiumok bizonyos fiziológiai folyamatát, amelyek szükségesek a klasszikus in vitro megtermékenyítéshez megtermékenyítéssel, például kapacitással, akroszóma reakcióval, a spermium kötődésével a zona pellucida – hoz, vagy hogy még néhány spermium szelekciót végez az ICSI.

ábra 2

a spermamintákban a spermafej vakuolái (a rossz spermiumok aránya: II.osztály plusz III. osztály) és a petesejtek megtermékenyítési aránya a klasszikus in vitro megtermékenyítés (IVF) után.

a blasztociszták arányát tekintve negatív korreláció volt () a spermamintákban a III. osztályú spermiumok százalékos aránya és a blasztociszták aránya között a klasszikus in vitro megtermékenyítés után, míg más korrelációt nem figyeltünk meg. Nem figyeltünk meg semmilyen összefüggést a spermium fej vakuolái és a terhesség aránya között, függetlenül az in vitro megtermékenyítés módszerétől. Pozitív összefüggés volt a terhesség és a női partnerben kinyert petesejtek száma között, amint azt a Mann-Whitney teszt kimutatta, de nem találtunk összefüggést a terhesség és a spermium fej vakuolái között. Ezt tovább erősítette a többváltozós logisztikus regresszió a női és férfi tényezők tekintetében, beleértve a spermium fej vakuoláit is.

a korábbi tanulmányok többsége megpróbálta tisztázni a spermium fej vakuolák hatását az ICSI kimenetelére rossz spermaminőségű férfiaknál, és néhányuk valóban megerősítette a negatív hatást . Vizsgálatunk előnye, hogy tisztáztuk a spermafej vacuolák hatását nemcsak az ICSI eredményére rossz minőségű spermamintákban (teratozoospermia), hanem a klasszikus IVF kimenetelére is normál spermamintákban (normál klasszikus spermaminőségi paraméterekkel, beleértve a morfológiát is). Adataink azt mutatják, hogy a spermafej vakuolái még károsabbak voltak a klasszikus IVF kimenetele szempontjából, mint az ICSI esetében.

3.2. Transzmissziós elektronmikroszkópia (tem)

hasonlóan az MSOME-hoz, a transzmissziós elektronmikroszkópia (tem) feltárta a spermium fej vakuoláit normál és abnormális spermamintákban. A spermiumfejekben lévő vakuolákat a sejtmagon belüli könnyebb területeknek tekintették, és mindkét típusú spermamintában szinte minden spermiumban jelen voltak (3(a) és 3(b) ábra). A spermium fej vakuoláinak elektronmikroszkópos felvételeit ritkán mutatják be az irodalomban, ultrastruktúrájuk értelmezése pedig kevés . Az emberi spermiumok finom szerkezetének leírása általában a spermiumfejekben nagy lucent területeket mutat be vakuolákként, a kisebb tiszta területeket pedig nukleoplazmaként vagy tiszta foltokként .

(a)

(b)

(c)

(d)

a)
b)
c)
d)

ábra 3

Normozoospermikus minták transzmissziós elektronmikrográfiái (tem) különböző méretű és helyzetű fejvakuolákkal. Nyíl jelzi vakuolák (b), (c), és RNE (d). A: akroszóma, N: nucleus, M: mitokondriumok és RNE: redundáns nukleáris burok.

ellentétben a könnyű mikrográfiákkal, ahol a vakuolákat felületi konkávoknak tekintik, az elektronmikrográfokban a vakuolákat alkalmanként dudorokként figyelték meg a sejtfelszínen (3.ábra(c)). A vakuolák és a kondenzált kromatin eltérő optikai sűrűsége miatt a membránokkal töltött magmélyedések felületi konkávokként jelennek meg fénymikroszkóp alatt.

3.2.1. A spermiumfej Vakuoláinak ultrastrukturális jellemzői

a spermiumfej vakuoláinak Elektronmikrográfiái membránhalmokat tartalmazó magmélyedéseket mutattak(4(c), 4(d) és 4 (f) ábra). Ezeket a membránokat koncentrikusan elrendezett lamellákként szervezték, és membrán örvényekként (MW) írják le, amelyek időnként kidudorodnak a sejtfelszínről. Különböző bonyolultságú membrán örvények voltak jelen a spermiummag különböző területein, és nagy területet foglalhatnak el a magban mind morfológiailag normális, mind abnormális spermiumokban. Szinte minden esetben a membrán örvényeket intakt akroszóma és plazmamembrán borította(4(c) és 4 (d) ábra). Többnyire szorosan csomagolt kettős membránokból álltak, elektronsűrű molekuláris szeptumokkal és vékonyabb membránokkal, amelyek flokkulens anyagot zártak be(4(d) és 4 (f) ábra). Franklin és Fussell membrán örvényeket figyeltek meg a késői hörcsög spermatidák apikális szubakroszomális terében, amelyek folyamatosak voltak a magburokkal. A szerzők szerint a membrán örvények nagyobbnak tűntek, és nagyobb számban voltak jelen a spermiogenezis végső vagy érési szakaszában.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

ábra 4

a normozoospermia ((a), (c), (d), (e) és (f)) és a teratozoospermia (B) spermiumfej-vakuolák TEM mikrográfiái. (a) nukleáris bemélyedések flokkulens anyagot körülvevő membránokkal (csillag). Kettős membrán molekuláris septa (nyíl) a nukleáris borítékból. (b) Nucleus tiszta foltok nem kondenzált kromatin (nyíl) és nagy terület flocculent anyag (csillag). C) koncentrikusan elrendezett membránokból álló membrán örvények (MW). (d) a membrán örvények nagy nagyítása (c). (e) a mag nagy részét elfoglaló membrán örvények (MW). (f) kettős membránok nagy nagyítása septum komplexekkel (nyíl) és vékony membránokkal (nyílfej). A: akroszóma; N: mag.

a spermiumok érése a nukleáris reorganizációhoz és méretének csökkenéséhez vezet. Az irodalomból ismert, hogy a nukleáris érés magában foglalja a nukleáris burok redukcióját, egy dinamikus kettős membránt, amely körülveszi a magot, elkülöníti a kromoszómákat, és szabályozza a nukleáris transzportot a pórusokon keresztül . Az átalakulás sok részlete még mindig nem tisztázott. A membrán örvények mikrográfiái azt mutatták, hogy a membránok folytonosak a magburokkal(5(a) és 5 (c) ábra). A septate elektron sűrű molekuláris komplexekkel rendelkező membránszerkezetek valószínűleg a nukleáris boríték átszervezése során keletkeznek. Ezeket a struktúrákat több szerző redundáns nukleáris borítékként (RNE) írta le . Az RNE látható a normál spermiumok mikrográfiájában(3.ábra (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

a)
b)
c)
d)

ábra 5

a spermiumok keresztmetszete normozoospermikus mintákban ((a), (b) és (c)) nagy nukleáris bemélyedésekkel, membrán örvényekkel (MW). Az akroszóma membrán nukleáris borítékkal (nyilakkal) van összekötve. (C) membrán örvények (MW) további membránokkal a mag és az akroszóma között (nyílhegy). d) a nem kondenzált kromatin nagy része, szemcsés képződéssel a rendellenes morfológiájú spermium magjában (nyíl). A: akroszóma, N: sejtmag és C: citoplazma.

a kromatin kondenzáció különböző szakaszai láthatók mikrográfiáinkban minden mintában. Az 5.ábrán(d) egy abnormális morfológiájú spermiumot láthatunk a kromatin kondenzáció folyamatában, amelyet még mindig nagy mennyiségű citoplazma vesz körül. A késői spermatogenezisben a spermium DNS szorosan becsomagolódik, mert a hisztonokat protaminokkal helyettesítik . Azonban gyakran előfordulnak kondenzációs hibák, amelyek szabálytalan alakú, különböző méretű tiszta tereket eredményeznek a magban . Ismert, hogy a kromatin kondenzáció meghibásodása kis és nagy vakuolák jelenlétével jár . Mikrográf felvételeink a nem kondenzált kromatin és magvakuolák kisebb elektron lucent területeit tárták fel, amelyek méretükben különböznek, és mindig amorf anyagot vagy/és membrán örvényeket tartalmaznak. Ezek jobban kifejeződhetnek a teratozoospermikus minták spermiumaiban, és összefüggésben lehetnek a rendellenes spermium érési folyamattal és a spermium fej vakuoláival. Koncentráltabb kutatásra van szükség.

az akroszóma teljesen kifejlődött a legtöbb spermiumban, spermiumfejű vakuolákkal. Néhány sejtben megfigyelték a belső akroszomális membrán és a magburok összekapcsolódását(5.A) és 5. B) ábra). Az akroszóma morfogenezis egy dinamikus folyamat, amely szoros kölcsönhatást jelent a Golgi komplex és a korai spermatid magburok között. Kimutatták, hogy a perinukleáris theca (PT) egy citoszkeletális szerkezet, amely lefedi az emlősök spermiummagját, és kimutatták, hogy fontos szerepet játszik a normális akroszóma képződésben .

Setti et al. egyes szerzők arról számolnak be, hogy a spermium vakuolák akroszomális eredetűek, és tükrözik a nem reagált akroszómát . A vakuolák jelenléte és az akroszomális reakcióra képes spermiumok közötti negatív kapcsolat ki van téve. Adataink azt mutatják, hogy a spermiumfej vakuolái egyedi struktúrák, általában ép akroszóma borítja.

abnormális spermiumok voltak jelen mindkét típusú spermamintában-normál és abnormális. A rendellenességek a spermiumok különböző összetevőit érintették, nevezetesen a kromatint, az akroszómát, a nyaki régiót, a mitokondriumokat, a farokot. A normozoospermikus mintákból több mikrográf abnormális spermatozoidot mutatunk be kevésbé kondenzált kromatinnal, hajlított nyakkal, atipikus akroszómával és abnormális fejformával (6.ábra).

(a)

(b)

(c)

(d)

a)
b)
c)
d)

ábra 6

(A), (b), (c) és (D) spermiumok normál spermamintákból, rendellenes morfológiával. A kromatin szemcsés és kevésbé sűrű, számos tiszta folttal (fehér nyilakkal). Az akroszóma abnormálisan képződik (a), részben képződik (d), és néha membrán örvényekhez kapcsolódik (b). c) hajlított nyak régió. A: akroszóma; N: mag.

3.2.2. A Spermafej vacuolák funkciója

jelenleg lehetetlen megállapítani, hogy mi a spermafej vacuolák valódi funkciója. A spermium ultrastruktúrájának mikrográfiái alapján azt javasoljuk, hogy a spermafej vakuolái eltávolíthatnak valamilyen ismeretlen eredetű anyagot a kromatinból. Mivel jelzik mind az egyik oldalon a spermium érési folyamatával, mind a másik oldalon a rendellenes kromatin-kondenzációval kapcsolatos potenciális kapcsolatot, feltételezhető, hogy a spermiumfej vakuolái részt vehetnek a hisztonok eltávolításában, ha protaminokkal helyettesítik őket. De még korai bármilyen következtetésre jutni, további kutatásokra van szükség.

4. Következtetések

ennek a tanulmánynak az eredményei azt mutatják, hogy a teratozoospermiában szenvedő férfiak spermamintáit a spermiumfej vacuolák megnövekedett aránya jellemzi, bár a normospermikus férfiak spermamintáiban is jelen vannak. Ez azt jelzi, hogy kóros állapothoz kapcsolódhatnak. A sperma ultrastruktúrájának mikrográfiái azt mutatják, hogy a sperma fej vakuolái membrán örvényekből állnak. A kromatin-kondenzáció eltéréseit leginkább kóros spermamintákban figyelték meg, és nem zárható ki, hogy ezek a kóros éréssel és a spermiumfej vakuoláival kapcsolatosak. A jelenség jobb megértéséhez további kutatásokra van szükség a különböző módszerek és a transzmissziós elektronmikroszkópia kombinálásával.

összeférhetetlenség

a szerzők kijelentik, hogy e cikk közzétételét illetően nincs összeférhetetlenségük.

Köszönetnyilvánítás

a szerzők szeretnék megköszönni a ljubljanai Egyetemi Orvosi Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Tanszékének ljubljanai IVF Laboratóriumának klinikai embriológusainak a Ljubljanai Egyetem biotechnikai Karának biológiai Tanszékének sperma és elektronmikroszkópos Laboratóriumának előkészítését.