Resumen
Las vacuolas de cabeza de esperma humano y su papel en la infertilidad masculina todavía no se conocen bien. El objetivo de este estudio fue identificar las características clínicas y ultraestructurales de las vacuolas de cabeza de esperma humano en hombres incluidos en el programa de fertilización in vitro: hombres con morfología espermática normal (normozoospermia) y alterada (teratozoospermia). Las muestras de esperma se observaron con un aumento de 6000 veces utilizando un examen de morfología de orgánulos de esperma móviles (MSOME). Se evaluó la proporción de espermatozoides con vacuolas en la cabeza y se relacionó con el resultado de la fertilización in vitro. Los espermatozoides de hombres con morfología espermática deteriorada se caracterizaron por una mayor proporción de vacuolas en la cabeza de los espermatozoides. Las vacuolas en la cabeza de los espermatozoides se relacionaron con una calidad del semen deteriorada (concentración, motilidad y morfología de los espermatozoides), pero no se vieron influidas por factores masculinos (volumen, altura, edad, peso o índice de masa corporal del semen). Además, las vacuolas de cabeza de esperma se relacionaron con la tasa de fertilización deteriorada simplemente después de la fertilización in vitro clásica (FIV), mientras que no hubo relación con el embarazo. En un subgrupo de hombres, el esperma se fijó y se observó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). El estudio ultraestructural reveló que las vacuolas de cabeza de esperma son grandes hendiduras nucleares de varios tamaños y posiciones, llenas de material membranoso organizado en verticilos de membrana (MW).
1. Introducción
La infertilidad masculina puede estar relacionada con la morfología anormal de los espermatozoides. En los últimos años, ha habido mucho debate sobre un nuevo parámetro potencial de la calidad del esperma y la fertilidad masculina, las vacuolas de cabeza de esperma. A pesar de eso, las vacuolas de cabeza de esperma humano y su papel potencial en la infertilidad masculina todavía no se conocen bien.
Utilizando el examen morfológico de orgánulos de esperma móviles (MSOME), donde se visualizan los espermatozoides vivos con microscopía DIC Nomarski con un aumento de 6000 veces, se ven algunas estructuras morfológicas finas que podrían ser útiles para determinar la calidad de los espermatozoides. Este método muestra concavidades superficiales pequeñas y grandes denominadas vacuolas de esperma, generalmente ubicadas en la cabeza de los espermatozoides. La naturaleza y el origen de las vacuolas de cabeza de esperma son todavía inciertos y no está claro si se originan en el núcleo o en el acrosoma u otras estructuras membranosas. Las vacuolas también se encuentran en casi todas las muestras con morfología espermática normal (> 14% de espermatozoides morfológicamente normales según los estrictos criterios de Kruger) y se localizan principalmente en la punta o área media de las cabezas de los espermatozoides . Las imágenes de deconvolución tridimensional, que detectan ADN, mostraron vacuolas como «concavidades nucleares» y la microscopía de fuerza atómica reveló una membrana plasmática intacta pero ligeramente hundida en el área de las vacuolas . Además, las imágenes microscópicas electrónicas de muestras de esperma en pacientes con morfología espermática anormal, teratozoospermia (< 14% de espermatozoides normales en la muestra de acuerdo con los estrictos criterios de Kruger), mostraron vacuolas exclusivamente en el área del núcleo espermático . La ubicación anterior de las vacuolas de cabeza de esperma llevó a la pregunta sobre su posible origen del acrosoma. La inducción de la reacción del acrosoma por el ionóforo A23587 , el líquido folicular y el ácido hialurónico disminuyó el porcentaje de espermatozoides con vacuolas en la cabeza, lo que sugirió que podrían estar relacionados con el acrosoma. Sin embargo, las vacuolas también están presentes en las muestras de esperma sin acrosoma (es decir, globozoospermia), lo que sugiere que no se originan en el acrosoma . Se demostró que las muestras con vacuolas grandes de cabeza de esperma (más del 13% de la superficie de la cabeza) tienen un mayor porcentaje de ADN fragmentado en comparación con aquellas con vacuolas pequeñas, así como una mayor frecuencia de anomalías cromosómicas . Las vacuolas de cabeza de esperma observadas bajo el alto aumento de la microscopía de luz se describieron como concavidades nucleares «de bolsillo» relacionadas con el fallo de la condensación de cromatina . Por el contrario, algunos investigadores no encontraron ninguna correlación entre las vacuolas grandes de la cabeza de los espermatozoides y el daño en el ADN o las anomalías cromosómicas . El modelado del núcleo espermático durante la espermiogénesis involucra nucleoproteínas, manchas microtubulares y material perinuclear que se sabe que participa en el anclaje del acrosoma en el núcleo y también constituye la teca perinuclear . Durante la espermiogénesis, el núcleo se reduce notablemente y los nucleosomas generalmente aparecen distribuidos de forma no aleatoria por todo el genoma. El ADN unido a nucleosomas puede permanecer ensamblado con matriz nuclear y se ve como un «espacio vacío» en imágenes electrónicas. Juntos podrían tener un papel importante en la estructura de la cromatina paterna después de la fertilización . En los últimos pasos de la espermiogénesis, el ADN nuclear se condensa altamente porque las histonas de nucleoproteínas son reemplazadas por protaminas . Durante el reemplazo de nucleoproteínas, muchas proteínas funcionales temporales se forman y degradan en sitios especiales de degradación. Se propuso que las bolsas nucleares en la base de la cabeza de los espermatozoides funcionaran como centros proteolíticos y el sitio de salida desde donde los residuos de proteínas salen del núcleo y pueden estar conectados funcionalmente con vacuolas .
Las vacuolas de cabeza de esperma son un parámetro interesante pero poco conocido de la calidad de los espermatozoides y la fertilidad masculina que parece estar relacionado con el resultado de la fertilización in vitro en hombres con calidad de esperma alterada . El origen y la dinámica de las vacuolas de cabeza de esperma no se entienden bien y su papel en la función de los espermatozoides es discutible. Algunos autores sugieren que las vacuolas de esperma son características normales de la cabeza de los espermatozoides , mientras que otros las describen como estructuras degenerativas relacionadas con la subfertilidad masculina . Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar los porcentajes de espermatozoides con vacuolas en la cabeza, tanto en las muestras de espermatozoides normales como en las muestras con morfología espermática deteriorada, y relacionarlos con el resultado de la fertilización in vitro. Además, se reconsideró la ultraestructura y la función de las vacuolas de cabeza de esperma en relación con la maduración de los espermatozoides, utilizando la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución.
2. Materiales y métodos
En este estudio, se examinaron las muestras de esperma de 81 hombres incluidos en el programa de fertilización in vitro: 40 hombres con morfología espermática normal y 41 hombres con morfología espermática anormal (teratozoospermia) de acuerdo con los estrictos criterios de Kruger (anormal: <14% de esperma normal). Las muestras de esperma fueron preparadas y utilizadas para la fertilización in vitro. Cada muestra de espermatozoides se preparó por centrifugación (300 g) durante 20 min en un gradiente de densidad de 100%/40% de PureSperm (Nidacon, Suecia) seguido de la técnica swim-up, donde se extrajeron los mejores espermatozoides de la muestra. Todas las muestras de espermatozoides normales se utilizaron para la fertilización in vitro clásica (FIV), mientras que las muestras con morfología espermática anormal se utilizaron para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) para fertilizar los ovocitos de la pareja femenina. Las muestras, que permanecieron después de la fertilización in vitro, se utilizaron para el examen morfológico de orgánulos de esperma móviles (MSOME) para evaluar el porcentaje de vacuolas de cabeza de esperma en cada muestra con un aumento de 6000 veces. Se compararon los porcentajes de espermatozoides con vacuolas en la cabeza y el resultado de la fertilización in vitro entre las muestras de espermatozoides normales y anormales. Utilizando la microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (TEM), se observó la ultraestructura de 10 muestras de hombres normozoospermicos y 6 muestras de hombres teratozoospermicos. Se buscó la función potencial y la estructura de las vacuolas, también en relación con el proceso de maduración espermática.
Esta investigación fue aprobada por el Comité Nacional de Ética Médica.
2.1. Parámetros clásicos de Calidad Seminal
Se evaluaron los parámetros clásicos, concentración y motilidad espermática y morfología de cada muestra espermática. Se suponía que la muestra de esperma era normal a una concentración ≥15 millones de espermatozoides por ml y ≥40% de espermatozoides móviles totales (progresivos y no progresivos) según los criterios de la OMS y a ≥14% de espermatozoides morfológicamente normales según los estrictos criterios de Kruger.
2.2. Examen Morfológico de Orgánulos de espermatozoides móviles (MSOME)
Para el examen morfológico de orgánulos de espermatozoides móviles, utilizamos gotitas de medio SpermSlow (Origio, Dinamarca) en un plato con fondo de vidrio (GWSt1000; Will Co, Wells, Ámsterdam, Países Bajos) y gotitas de muestra de espermatozoides preparadas mediante la técnica swim-up, descrita previamente por Knez . Los espermatozoides de cada muestra se monitorizaron bajo un microscopio invertido con una platina calentada equipada con contraste de interferencia diferencial (Eclipse TE2000-S; Nikon, Japón). Se colocó una gotita delgada y alargada de espermatozoides en medio lento (Origio, Dinamarca) en el fondo de un plato de vidrio. Se colocó una gotita más pequeña de espermatozoides preparados cerca de la gotita baja de espermatozoides y los espermatozoides unidos al hialuronato. Todas las gotitas se cubrieron con aceite de parafina para evitar que la muestra de esperma se secara. Para la observación con un aumento de 6000, se insertó una gota de aceite de inmersión debajo del plato de vidrio (debajo de la gota de esperma). Se monitorizó una gota de espermatozoides con espermatozoides unidos mediante el objetivo de inmersión, contraste de interferencia diferencial y una cámara Nikon Digital Sight DS-Ri1. En cada muestra, se seleccionaron 200 espermatozoides unidos al hialuronato y se evaluaron de acuerdo con las vacuolas de la cabeza, con un aumento de 6000 veces. El sistema de puntuación para la evaluación de cada espermatozoide se basó en la siguiente clasificación de Vanderzwalmen . De acuerdo con el número de vacuolas y su tamaño, los espermatozoides se clasificaron en: Clase I: ausencia de vacuolas, Clase II: máximo de dos vacuolas pequeñas, Clase III: más de dos vacuolas pequeñas o al menos una vacuola grande, y Clase IV: vacuolas grandes junto con formas anormales de la cabeza u otras anomalías. En cada muestra de espermatozoides se evaluaron las proporciones de espermatozoides de Clase I, Clase II, Clase III y Clase IV. Para las estadísticas, las proporciones de espermatozoides de Clase I y Clase II se combinaron en un grupo, «espermatozoides buenos», y las proporciones de espermatozoides de Clase III y Clase IV en un grupo, «espermatozoides malos», en 3 términos de vacuolas de cabeza de espermatozoides.
2.3. Microscopía Electrónica de transmisión (TEM)
Para describir las características ultraestructurales de las vacuolas en el núcleo espermático, se centrifugaron muestras de esperma seleccionadas a 500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se eliminaron cuidadosamente y los gránulos se fijaron en un 2,5% de glutaraldehído y un 1% de paraformaldehído en 0.1 M de PB (tampón de fosfato de Sörensen), pH 7,0 durante 24 h a 4°C, postfijado con OsO4 al 1% en 0,1 M de PB durante 1,5 h, e incrustado en resina de Agar 100 (Agar Scientific). Las secciones ultrafinas se teñieron con solución acuosa al 4% de acetato de uranilo y citrato de plomo de Reynolds. Las muestras se examinaron con el microscopio electrónico Philips CM 100 (FEI, Países Bajos), operando a 80 kV; las imágenes se grabaron con la cámara Bioscan 792 y Orius 200 (Gatan) utilizando un software de Micrografía Digital (Gatan Inc. Washington , DC, USA) a ampliaciones de 1100 a 92000 veces.
2.4. Análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias en los porcentajes de espermatozoides con vacuolas de cabeza de espermatozoide y el resultado de la fertilización in vitro (tasa de embarazo) entre las muestras de espermatozoides normales y las muestras con morfología anormal (teratozoospermia) se evaluó mediante la prueba de chi cuadrado. Los porcentajes de «espermatozoides buenos» (Clase I y Clase II), «espermatozoides malos» (Clase III y Clase IV) y espermatozoides de Clase I, II, III y IV en términos de vacuolas de cabeza de esperma se correlacionaron con parámetros clásicos de calidad del semen (concentración, motilidad y morfología), factores masculinos (volumen de semen, leucocitospermia, edad, altura, peso e índice de masa corporal) y el resultado de la fertilización in vitro (fertilización, blastocitos y tasas de embarazo) utilizando la correlación rho de Spearman. Para el resultado de la fertilización in vitro, los datos se evaluaron para los ciclos totales de fertilización in vitro y por separado para la fertilización in vitro clásica (FIV) y la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI). La dependencia del embarazo de factores femeninos y masculinos (incluidas vacuolas de cabeza de esperma) se evaluó mediante regresión logística multivariante. La significación estadística se fijó en .
3. Resultados y Discusión
3.1. Examen Morfológico de Orgánulos de Esperma Móviles (MSOME)
3.1.1. Vacuolas de Cabeza de espermatozoides observadas por Microscopía de luz de MSOME
En ambas muestras de espermatozoides normales y anormales, las vacuolas se localizaron en diferentes partes de la cabeza de los espermatozoides. Se veían como concavidades superficiales o áreas translúcidas más claras de varios tamaños y números. En la literatura, las vacuolas de cabeza de esperma se describen como concavidades superficiales, concavidades nucleares en forma de bolsillo o huellas digitales nucleares bajo el microscopio de luz. En nuestro estudio, el MSOME, utilizando microscopía Nomarski DIC a 6000 aumentos, mostró vacuolas de cabeza de esperma como concavidades superficiales (Figura 1). Sin embargo, debemos tener en cuenta que la microscopía DIC de Nomarski da como resultado una imagen pseudo-3D debido a la refracción de la luz que pasa a través de la muestra de diferente grosor y densidad óptica. Por lo tanto, es posible que las regiones nucleares de diferente densidad óptica no sean solo concavidades, sino también protuberancias irregulares en la superficie celular.
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los Espermatozoides con cabeza de vacuolas en es decir, normozoospérmico (a), (c) y (e)) y teratozoospermic (b), (d) y (f)) muestras observadas con microscopía DIC (Nomarski)a 6000 aumentos.
3.1.2. Vacuolas de Cabeza de Esperma, Parámetros Clásicos de Calidad de Esperma y Factores Masculinos
Nuestros datos muestran que las vacuolas de cabeza de esperma estaban presentes tanto en las muestras de esperma normales como anormales (Figura 1). Curiosamente, hubo una proporción relativamente alta (74,6%) de espermatozoides con vacuolas de cabeza de esperma en los espermatozoides de calidad normal, lo que indica que las vacuolas de cabeza de esperma también se encuentran en hombres normospermicos (Tabla 1). Aunque hubo una mayor proporción de espermatozoides con vacuolas en la cabeza en hombres con teratozoospermia que en hombres con calidad espermática normal (90,2% versus 74,6%;), como se puede ver en la Tabla 1, no se excluye que las vacuolas en la cabeza de espermatozoides también puedan estar relacionadas con la patología espermática en estos hombres. Además, en el esperma de hombres con teratozoospermia, hubo una proporción significativamente menor de espermatozoides óptimos de Clase I y una proporción mayor de espermatozoides de baja calidad de Clases III y IV que en muestras de espermatozoides normales (Tabla 1)
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| diferencia Estadísticamente significativa (). * * Diferencia estadísticamente significativa (), revelada por la prueba de chi cuadrado. |
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Sin embargo, algunos estudios previos reportaron mayores porcentajes de espermatozoides vacuolados en hombres subfértiles con parámetros seminales normales, variando de 97,7% a 98,4% . Esta discrepancia refleja el hecho de que los hombres subfértiles con calidad seminal normal pero incluidos en el programa de fertilización in vitro representan una población heterogénea de hombres, desde parejas fértiles de mujeres infértiles hasta hombres con resultados repetidos de fertilización in vitro pobres a pesar de la calidad seminal normal. Además, hay varios hábitos, estilos de vida y afecciones de salud diferentes (por ejemplo, inflamación y varicocele) que pueden afectar a sus espermatozoides en términos de vacuolas en la cabeza. Hubo una correlación positiva entre la proporción de «espermatozoides buenos» (Clase I y Clase II) en términos de vacuolas de cabeza y concentración de espermatozoides y morfología de espermatozoides (porcentaje de espermatozoides normales) en hombres incluidos en este estudio, como se puede ver en la Tabla 2.
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| la Correlación es significativa al nivel de 0.05 (2-tailed). * * La correlación es significativa en el nivel de 0,01 (2 colas). |
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Además, hubo una correlación positiva entre la proporción de espermatozoides de Clase I y la concentración de espermatozoides, la motilidad y la morfología. Por otro lado, hubo una correlación negativa entre la proporción de «espermatozoides malos» (Clase III y Clase IV) en términos de vacuolas de cabeza y concentración y morfología de espermatozoides (Tabla 2). Además, las proporciones de espermatozoides de Clase III y Clase IV se correlacionaron negativamente con la morfología de los espermatozoides y las proporciones de espermatozoides de Clase IV también se correlacionaron negativamente con la motilidad de los espermatozoides. Todos estos datos indican que las vacuolas en la cabeza de los espermatozoides estaban relacionadas con la calidad de los espermatozoides deteriorada, aunque también estaban presentes en muestras de espermatozoides normales. Este hallazgo está de acuerdo con algunos estudios previos .
Curiosamente, hubo una correlación negativa significativa entre la edad masculina y la concentración de espermatozoides, mientras que no observamos ninguna correlación entre las vacuolas de cabeza de espermatozoides y los factores masculinos como la edad, la altura, el peso y el índice de masa corporal (Tabla 3).
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| La correlación es significativa al nivel de 0.05 (2-tailed). IMC: índice de masa corporal. |
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Tampoco encontramos ninguna correlación significativa entre el volumen de semen o la leucocitospermia y las vacuolas de cabeza de esperma. Por otro lado, hubo más estudios previos que mostraron que algunos de estos factores masculinos pueden tener un impacto en la calidad del esperma y la formación de vacuolas en la cabeza . Uno de estos estudios mostró que el aumento de la edad masculina y el índice de masa corporal están relacionados con el aumento de las vacuolas en la cabeza de los espermatozoides, pero esto puede compensarse con una mayor frecuencia de eyaculación y un período más corto de abstinencia sexual en estos hombres . Esto significa que algunos otros factores masculinos aún desconocidos afectan la apariencia de las vacuolas de cabeza de esperma.
3.1.3. Vacuolas de Cabeza de Esperma y Resultado de la Fertilización In Vitro
Los grupos de hombres incluidos en el estudio no difieren en cuanto a la edad media de las parejas femeninas y el número de ovocitos por mujer, los principales factores femeninos que pueden afectar el resultado de la fertilización in vitro (Tabla 4). Las tasas de embarazo alcanzadas en hombres teratozoospermicos y normozoospermicos fueron del 32,5% y del 26,8% (ver Tabla 4).
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| La significación estadística se fijó en . | ||||||||||||||||||||||||||||||
Mediante una inspección posterior, quedó claro que la proporción de «espermatozoides buenos» o «espermatozoides malos» en términos de vacuolas de cabeza en muestras de semen era indicativa de una proporción de ovocitos fertilizados (tasa de fertilización) después del procedimiento de fertilización in vitro, pero esto dependía del método de fertilización in vitro. Después de la fertilización in vitro clásica (FIV), hubo una correlación positiva significativa entre el porcentaje de «espermatozoides buenos» en la muestra de semen y la tasa de fertilización (Tabla 5). Por otro lado, hubo una correlación negativa entre la proporción de «espermatozoides malos» y la tasa de fertilización, como se puede ver en la Tabla 5.
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| Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed). IVF: classical in vitro fertilization; ICSI: intracytoplasmic sperm injection. |
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En la Figura 2, se puede ver que, en muestras de semen con más de ~50% de» espermatozoides malos » en términos de vacuolas de cabeza de espermatozoides, la tasa de fertilización disminuyó. Curiosamente, no observamos ninguna correlación entre las vacuolas de cabeza de esperma y la tasa de fertilización después de la inyección intracitoplasmática (ICSI), como se encontró en algunos estudios anteriores . Esto indica que las vacuolas en la cabeza de los espermatozoides pueden afectar algunos procesos fisiológicos de los espermatozoides que son necesarios para la fertilización in vitro clásica por inseminación, como la capacitación, la reacción acrosómica, la unión de los espermatozoides a la zona pelúcida, o que la ICSI realiza más selección de espermatozoides.
Relación entre vacuolas de cabeza de esperma (proporción de espermatozoides malos: Clase II más Clase III) en muestras de semen y tasa de fertilización de ovocitos después de la fertilización in vitro clásica (FIV).
En cuanto a la tasa de blastocitos, hubo una correlación negativa () entre el porcentaje de espermatozoides de Clase III en muestras de semen y la tasa de blastocitos después de la fertilización in vitro clásica, mientras que no observamos ninguna otra correlación. No se observó ninguna correlación entre las vacuolas de cabeza de esperma y la tasa de embarazo, independientemente del método de fertilización in vitro. Hubo una relación positiva entre el embarazo y el número de ovocitos recuperados en la pareja femenina, según lo revelado por la prueba de Mann-Whitney, pero no encontramos ninguna relación entre el embarazo y las vacuolas de cabeza de espermatozoides. Esto se confirmó aún más mediante regresión logística multivariante con respecto a factores femeninos y masculinos, incluidas las vacuolas de cabeza de esperma.
La mayoría de los estudios anteriores han tratado de dilucidar el efecto de las vacuolas de cabeza de esperma en el resultado de ICSI en hombres con mala calidad de semen y algunos de ellos confirmaron el efecto negativo . La ventaja de nuestro estudio es que dilucidamos el efecto de las vacuolas de cabeza de esperma no solo en el resultado de ICSI en muestras de semen de mala calidad (teratozoospermia), sino también en el resultado de FIV clásica en muestras de semen normales (con parámetros clásicos normales de calidad del semen, incluida la morfología). Nuestros datos indican que las vacuolas de cabeza de esperma fueron aún más perjudiciales para el resultado de la FIV clásica que para la ICSI.
3.2. Microscopía Electrónica de transmisión (TEM)
De manera similar, al igual que en MSOME, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló las vacuolas de cabeza de esperma en muestras de esperma normales y anormales. Las vacuolas en las cabezas de los espermatozoides se veían como áreas más claras dentro del núcleo y estaban presentes en casi todos los espermatozoides de ambos tipos de muestras de espermatozoides (Figuras 3(a) y 3(b)). Las micrografías electrónicas de vacuolas de cabeza de esperma rara vez se presentan en la literatura y la interpretación de su ultraestructura es escasa . La descripción de la estructura fina de los espermatozoides humanos generalmente presenta grandes áreas lucentes en las cabezas de los espermatozoides como vacuolas y áreas claras más pequeñas como nucleoplasma o manchas claras .
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micrografías electrónicas de Transmisión (TEM) es decir, normozoospérmico de muestras con la cabeza en las vacuolas de diferentes tamaño y la posición. La flecha indica vacuolas en (b), (c) y RNE en (d). A: acrosoma, N: núcleo, M: mitocondrias, y RNE: envoltura nuclear redundante.
Contrariamente a las micrografías de luz, donde las vacuolas se ven como concavidades superficiales, en las micrografías electrónicas, las vacuolas se observaron ocasionalmente como protuberancias en la superficie de la célula (Figura 3(c)). Debido a la diferente densidad óptica de las vacuolas y la cromatina condensada, las hendiduras nucleares llenas de membranas aparecen como concavidades superficiales bajo microscopía de luz.
3.2.1. Las características ultraestructurales de las Vacuolas de Cabeza de esperma
Micrografías electrónicas de vacuolas de cabeza de esperma mostraron hendiduras nucleares que contenían pilas de membranas (Figuras 4(c), 4(d) y 4(f)). Estas membranas se organizaron como láminas dispuestas concéntricamente y se describen como espirales de membrana (MW), que ocasionalmente sobresalen de la superficie celular. Verticilos de membrana de varias complejidades estaban presentes en diferentes áreas del núcleo espermático y pueden ocupar una gran área del núcleo tanto en espermatozoides morfológicamente normales como anormales. En casi todos los casos, los verticilos de membrana estaban cubiertos por un acrosoma y una membrana plasmática intactos (Figuras 4 c) y 4 d)). Se componían en su mayoría de membranas dobles compactas con septos moleculares densos de electrones y membranas más delgadas que encerraban material floculento(Figuras 4(d) y 4 (f)). Franklin y Fussell observaron verticilos de membrana en el espacio subacrosómico apical de espermátidas tardías de hámster que eran continuas con la envoltura nuclear. Según los autores, los verticilos de membrana parecían más grandes y estaban presentes en mayor número en la fase final o de maduración de la espermiogénesis.
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micrografías de TEM de la cabeza de los espermatozoides vacuolas de normozoospermia (a), (c), (d), (e) y (f)) y teratozoospermia (b). a) Hendiduras nucleares con membranas que encierran material floculento (asterisco). Doble membrana con septos moleculares (flecha) que emergen de la envoltura nuclear. b) Núcleo con manchas claras de cromatina no condensada (flecha) y gran área con material floculento (asterisco). c) Verticilos de membrana (MW) formados por membranas dispuestas concéntricamente. d) Gran aumento de los verticilos de membrana de (c). e) Verticilos de membrana (MW) que ocupan una gran parte del núcleo. f) Gran aumento de membranas dobles con complejos septales (flecha) y membranas delgadas (cabeza de flecha). A: acrosoma; N: núcleo.
La maduración de los espermatozoides conduce a la reorganización nuclear y a la reducción de su tamaño. De la literatura, se sabe que la maduración nuclear implica la reducción de la envoltura nuclear, una membrana doble dinámica que rodea el núcleo, segrega los cromosomas y regula el transporte nuclear a través de los poros . Muchos detalles de su transformación aún no están claros. Nuestras micrografías de espirales de membrana mostraron la continuidad de las membranas con la envoltura nuclear(Figuras 5(a) y 5 (c)). Las estructuras de membrana con complejos moleculares densos de electrones septados probablemente se producen durante la reorganización de la envoltura nuclear. Estas estructuras fueron descritas por varios autores como envolvente nuclear redundante (RNE) . La RNE se observa en nuestra micrografía de espermatozoides normales (Figura 3 (d)).
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secciones transversales de los espermatozoides en es decir, normozoospérmico muestras (a), (b)y (c)) con grandes hendiduras nucleares con membrana verticilos (MW). La membrana del acrosoma está conectada con una envoltura nuclear (flechas). c) Verticilos de membrana (MW) con membranas adicionales entre el núcleo y el acrosoma (punta de flecha). d) Gran parte de cromatina no condensada con formación granular en el interior del núcleo (flecha) del espermatozoide con morfología anormal. A: acrosoma, N: núcleo y C: citoplasma.
En nuestras micrografías de todas las muestras se observan diferentes etapas de condensación de cromatina. En la Figura 5 (d), podemos ver un espermatozoide con morfología anormal en un proceso de condensación de cromatina que todavía está rodeado de gran cantidad de citoplasma. En la espermatogénesis tardía, el ADN de los espermatozoides se vuelve apretado porque las histonas son reemplazadas por protaminas . Sin embargo, los defectos de condensación ocurren con frecuencia y dan lugar a espacios claros de forma irregular de varios tamaños en el núcleo . Se sabe que la falla de condensación de cromatina está asociada con la presencia de vacuolas pequeñas y grandes . Nuestras micrografías revelaron áreas de electrones lucentes más pequeñas de cromatina no condensada y vacuolas nucleares que difieren en tamaño y siempre contienen material amorfo o espirales de membrana. Pueden expresarse más en espermatozoides de muestras teratozoospermicas y pueden estar relacionados con el proceso de maduración anormal de los espermatozoides y las vacuolas en la cabeza de los espermatozoides. Sin embargo, se requiere una investigación más centrada.
El acrosoma se desarrolló completamente en la mayoría de los espermatozoides con vacuolas en la cabeza de los espermatozoides. En algunas células, se observaron interconexiones de la membrana acrosomal interna y la envoltura nuclear (Figuras 5(a) y 5(b)). La morfogénesis acrosómica es un proceso dinámico que implica una estrecha interacción entre el complejo de Golgi y la envoltura nuclear de las espermátidas tempranas. Se ha demostrado que la teca perinuclear (TP) es una estructura citoesquelética que cubre el núcleo espermático de los mamíferos y que desempeña un papel importante en la formación normal de acrosomas .
Según lo revisado por Setti et al. , algunos autores informan que las vacuolas de espermatozoides son de origen acrosómico y reflejan un acrosoma sin reacción . Se expone una relación negativa entre la presencia de vacuolas y la capacidad de los espermatozoides para experimentar la reacción acrosómica. Nuestros datos muestran que las vacuolas de cabeza de esperma son estructuras únicas, generalmente cubiertas por acrosomas intactos.
espermatozoides anormales estaban presentes en ambos tipos de muestras de espermatozoides, normales y anormales. Las anomalías afectaron a diferentes componentes de las células espermáticas, a saber, cromatina, acrosoma, región del cuello, mitocondrias y cola. Presentamos varias micrografías de espermatozoides anormales de muestras normozoospermicas con cromatina menos condensada, cuello doblado, acrosoma atípico y forma de cabeza anormal (Figura 6).
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(a), (b), (c), y (d) los Espermatozoides de la normal de muestras de semen con morfología anormal. La cromatina es granular y menos condensada con numerosas manchas claras (flechas blancas). El acrosoma está anormalmente formado (a), parcialmente formado (d), y a veces conectado a espirales de membrana (b). c) Región del cuello doblado. A: acrosoma; N: núcleo.
3.2.2. Función de las vacuolas de cabeza de esperma
En la actualidad, es imposible afirmar cuál es la función real de las vacuolas de cabeza de esperma. Basándonos en nuestras micrografías de ultraestructura de espermatozoides, sugerimos que las vacuolas de cabeza de espermatozoides pueden eliminar alguna sustancia de origen desconocido de la cromatina. Debido a que indican la relación potencial con el proceso de maduración de los espermatozoides en un lado y la condensación anormal de cromatina en el otro, se puede especular que las vacuolas de la cabeza de los espermatozoides pueden estar involucradas en la eliminación de histonas cuando se reemplazan por protaminas. Pero es demasiado pronto para llegar a una conclusión y se necesita más investigación.
4. Conclusiones
Los resultados de este estudio indican que las muestras de espermatozoides de hombres con teratozoospermia se caracterizan por un aumento de la proporción de vacuolas de cabeza de espermatozoides, aunque también están presentes en muestras de espermatozoides de hombres normospermicos. Esto indica que pueden estar relacionados con el estado patológico. Nuestras micrografías en la ultraestructura de espermatozoides indican que las vacuolas de cabeza de espermatozoide están compuestas de espirales de membrana. Las variaciones en la condensación de cromatina se observaron principalmente en muestras de esperma anormales y no se excluye que estén relacionadas con la maduración anormal y las vacuolas de cabeza de esperma. Se necesita más investigación que combine diferentes métodos y microscopía electrónica de transmisión para dilucidar mejor este fenómeno.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los embriólogos clínicos del Laboratorio de FIV de Ljubljana, Departamento de Obstetricia y Ginecología, Centro Médico Universitario de Ljubljana, por preparar el semen y el Laboratorio para Microscopía Electrónica del Departamento de Biología, Facultad de Biotecnología, Universidad de Ljubljana.