Klinische und strukturelle Merkmale der Spermienkopfvakuolen bei Männern im Rahmen des In-Vitro-Fertilisationsprogramms

Zusammenfassung

Die menschlichen Spermienkopfvakuolen und ihre Rolle bei der männlichen Unfruchtbarkeit sind noch wenig verstanden. Ziel dieser Studie war es, die klinischen und ultrastrukturellen Merkmale menschlicher Spermienkopfvakuolen bei Männern zu identifizieren, die in das In-vitro-Fertilisationsprogramm aufgenommen wurden: Männer mit normaler (Normozoospermie) und beeinträchtigter Spermienmorphologie (Teratozoospermie). Die Spermienproben wurden unter 6000-facher Vergrößerung mittels motile sperm organelle morphology Examination (MSM) beobachtet. Der Anteil der Spermien mit Kopfvakuolen wurde bewertet und mit dem Ergebnis der In-vitro-Fertilisation in Verbindung gebracht. Das Sperma von Männern mit eingeschränkter Spermienmorphologie war durch einen höheren Anteil an Spermienkopfvakuolen gekennzeichnet. Die Samenkopfvakuolen standen im Zusammenhang mit einer beeinträchtigten Samenqualität (Spermienkonzentration, Motilität und Morphologie), wurden jedoch nicht von männlichen Faktoren (Samenvolumen, Größe, Alter, Gewicht oder Body-Mass-Index) beeinflusst. Darüber hinaus waren Spermienkopfvakuolen lediglich nach der klassischen In-vitro-Fertilisation (IVF) mit einer beeinträchtigten Befruchtungsrate verbunden, während kein Zusammenhang mit einer Schwangerschaft bestand. In einer Untergruppe von Männern wurde das Sperma fixiert und durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Die ultrastrukturelle Studie ergab, dass Spermienkopfvakuolen große Kerneinbuchtungen verschiedener Größen und Positionen sind, die mit membranösem Material gefüllt sind, das in Membranwirbeln (MW) organisiert ist.

1. Einleitung

Männliche Unfruchtbarkeit kann mit einer abnormalen Morphologie der Spermatozoen zusammenhängen. In den letzten Jahren wurde viel über einen neuen potenziellen Parameter der Spermienqualität und der männlichen Fruchtbarkeit diskutiert, die Spermienkopfvakuolen. Trotzdem sind die menschlichen Spermienkopfvakuolen und ihre mögliche Rolle bei männlicher Unfruchtbarkeit noch wenig verstanden.

Bei der Untersuchung der Morphologie beweglicher Spermien (Motile sperm organelle morphology Examination, MSM), bei der lebende Spermien mit der DIC Nomarski-Mikroskopie bei 6000-facher Vergrößerung sichtbar gemacht werden, sind einige feine morphologische Strukturen sichtbar, die zur Bestimmung der Spermienqualität nützlich sein können. Diese Methode zeigt kleine und größere Oberflächenkonkavitäten, die als Spermienvakuolen bezeichnet werden und sich normalerweise im Kopf der Samenzellen befinden. Die Art und der Ursprung der Spermienkopfvakuolen sind noch ungewiss und es ist nicht klar, ob sie aus dem Kern oder dem Akrosom oder anderen membranösen Strukturen stammen. Vakuolen finden sich auch in fast allen Proben mit normaler Spermienmorphologie (>14% morphologisch normale Spermatozoen nach Krügers strengen Kriterien) und befinden sich hauptsächlich im Spitzen- oder Mittelbereich der Spermienköpfe . Die dreidimensionalen Dekonvolutionsbilder, die DNA nachweisen, zeigten Vakuolen als „Kernkonkavitäten“ und die Rasterkraftmikroskopie zeigte intakte, aber leicht versunkene Plasmamembranen im Bereich der Vakuolen . Darüber hinaus zeigten die elektronenmikroskopischen Bilder von Spermienproben bei Patienten mit abnormaler Spermienmorphologie, Teratozoospermie (< 14% normale Spermatozoen in der Probe nach Krügers strengen Kriterien), Vakuolen ausschließlich im Bereich des Spermienkerns . Die vordere Lage der Spermienkopfvakuolen führte zu der Frage nach ihrer möglichen Herkunft aus dem Akrosom. Die Induktion der Akrosomenreaktion durch Ionophor A23587 , Follikelflüssigkeit und Hyaluronsäure verringerte den Prozentsatz der Spermatozoen mit Kopfvakuolen, was darauf hindeutete, dass sie mit dem Akrosom verwandt sein könnten. Vakuolen sind jedoch auch in den Spermienproben ohne Akrosom (d. H. Globozoospermie) vorhanden, was darauf hindeutet, dass sie nicht aus dem Akrosom stammen . Es wurde gezeigt, dass Proben mit großen Spermienkopfvakuolen (mehr als 13% der Kopffläche) einen höheren Prozentsatz an fragmentierter DNA aufweisen als Proben mit kleinen Vakuolen sowie eine höhere Häufigkeit von Chromosomenanomalien . Die Spermienkopfvakuolen, die unter der hohen Vergrößerung der Lichtmikroskopie beobachtet wurden, wurden als „taschenartige“ Kernkonkavitäten beschrieben, die mit dem Versagen der Chromatinkondensation zusammenhängen . Im Gegenteil, einige Forscher fanden keine Korrelation zwischen den großen Spermienkopfvakuolen und DNA-Schäden oder Chromosomenanomalien . Die Spermienkernmodellierung während der Spermiogenese umfasst Nukleoproteine, mikrotubuläre Manchette, und perinukleäres Material, von dem bekannt ist, dass es an der Akrosomenverankerung am Kern beteiligt ist und auch die perinukleäre Theca darstellt . Während der Spermiogenese wird der Kern auffallend reduziert und die Nukleosomen erscheinen normalerweise nicht zufällig im gesamten Genom verteilt. Die nukleosomengebundene DNA kann mit der Kernmatrix zusammengebaut bleiben und wird in elektronischen Bildern als „leerer Raum“ angesehen. Zusammen könnten sie eine wichtige Rolle in der väterlichen Chromatinstruktur nach der Befruchtung spielen . In den späten Schritten der Spermiogenese wird die Kern-DNA stark kondensiert, da die Nukleoproteine Histone durch Protamine ersetzt werden . Beim Ersatz von Nukleoproteinen werden viele temporär funktionelle Proteine gebildet und an speziellen Abbaustellen abgebaut. Es wurde vorgeschlagen, dass die Kerntaschen an der Basis des Spermienkopfes als proteolytische Zentren und als Austrittsstelle fungieren, von wo aus die Proteinreste den Kern verlassen und funktionell mit Vakuolen verbunden sein können .

Die Spermienkopfvakuolen sind ein interessanter, aber wenig verstandener Parameter der Spermienqualität und der männlichen Fruchtbarkeit, der mit dem Ergebnis der In-vitro-Fertilisation bei Männern mit eingeschränkter Spermienqualität in Zusammenhang zu stehen scheint . Der Ursprung und die Dynamik von Spermienkopfvakuolen sind nicht gut verstanden und ihre Rolle bei der Spermienfunktion ist umstritten. Einige Autoren schlagen vor, dass Spermienvakuolen normale Merkmale des Spermienkopfes sind , während andere sie als degenerative Strukturen beschreiben, die mit der männlichen Subfertilität zusammenhängen . Ziel dieser Studie war es daher, die Prozentsätze von Spermien mit Kopfvakuolen sowohl in den normalen Spermienproben als auch in Proben mit eingeschränkter Spermienmorphologie zu bewerten und mit dem Ergebnis der In-vitro-Fertilisation in Beziehung zu setzen. Darüber hinaus wurden die Ultrastruktur und Funktion von Spermienkopfvakuolen in Bezug auf die Spermienreifung unter Verwendung der hohen Auflösung der Transmissionselektronenmikroskopie überprüft.

2. Materialien und Methoden

In dieser Studie wurden die Spermienproben von 81 Männern, die in das In-vitro-Fertilisationsprogramm aufgenommen wurden, untersucht: 40 Männer mit normaler Spermienmorphologie und 41 Männer mit abnormaler Spermienmorphologie (Teratozoospermie) nach Krugers strengen Kriterien (abnormal: <14% normale Spermien). Die Spermienproben wurden vorbereitet und für die In-vitro-Fertilisation verwendet. Jede Spermienprobe wurde durch Zentrifugation (300 g) für 20 min an einem 100% / 40% Dichtegradienten von PureSperm (NidaCon, Schweden) hergestellt, gefolgt von der Swim-up-Technik, bei der die besten Spermatozoen aus der Probe extrahiert wurden. Alle normalen Spermienproben wurden für die klassische In-vitro-Fertilisation (IVF) verwendet, während die Proben mit abnormaler Spermienmorphologie für die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) verwendet wurden, um die Eizellen der Partnerin zu befruchten. Die Proben, die nach der In-vitro-Fertilisation zurückblieben, wurden für die Untersuchung der Morphologie der beweglichen Spermienorganellen (Motile sperm Organelle morphology Examination, MSM) verwendet, um den Prozentsatz der Spermienkopfvakuolen in jeder Probe unter 6000-facher Vergrößerung zu bewerten. Die Prozentsätze der Spermien mit Kopfvakuolen und das Ergebnis der In-vitro-Fertilisation wurden zwischen den normalen und abnormalen Spermienproben verglichen. Unter Verwendung der hohen Auflösung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde die Ultrastruktur von 10 Proben normozoospermischer Männer und 6 Proben teratozoospermischer Männer beobachtet. Die potentielle Funktion und Struktur von Vakuolen wurde untersucht, auch in Bezug auf den Reifungsprozess der Spermien.

Diese Forschung wurde von der National Medical Ethics Committee genehmigt.

2.1. Klassische Parameter der Samenqualität

Die klassischen Parameter, Spermienkonzentration und Motilität und Morphologie jeder Spermienprobe, wurden bewertet. Die Spermienprobe sollte bei einer Konzentration von ≥15 Millionen Spermatozoen pro ml und ≥40% der gesamten (progressiven und nicht progressiven) beweglichen Spermatozoen nach WHO-Kriterien und bei ≥14% der morphologisch normalen Spermatozoen nach Krügers strengen Kriterien normal sein.

2.2. Untersuchung der Morphologie beweglicher Spermien (MSM)

Für die Untersuchung der Morphologie beweglicher Spermien verwendeten wir Tröpfchen von SpermSlow Medium (Origio, Dänemark) in einer Schüssel mit Glasboden (GWSt1000; Will Co, Wells, Amsterdam, Niederlande) und Tröpfchen einer Spermienprobe, die durch die zuvor von Knez beschriebene Swim-up-Technik hergestellt wurden. Die Spermatozoen in jeder Probe wurden unter einem invertierten Mikroskop mit einem beheizten Tisch mit differentiellem Interferenzkontrast (Eclipse TE2000-S; Nikon, Japan) überwacht. Ein dünnes, längliches Tröpfchen spermienlanges Medium (Origio, Dänemark) wurde auf den Boden einer Glasschale gelegt. Ein kleineres Tröpfchen vorbereiteter Spermatozoen wurde in die Nähe von Spermien gebrachtlanges Tröpfchen und an Hyaluronat gebundene Spermatozoen. Alle Tröpfchen wurden mit Paraffinöl bedeckt, um ein Austrocknen der Spermienprobe zu verhindern. Zur Beobachtung unter 6000-facher Vergrößerung wurde ein Tropfen Immersionsöl unter die Glasschale (unter dem SpermSlow-Tropfen) eingeführt. Ein Tröpfchen von Spermien mit gebundenen Spermatozoen wurde mit dem Immersionsobjektiv, dem differentiellen Interferenzkontrast und einer Nikon Digital Sight DS-Ri1-Kamera überwacht. In jeder Probe wurden 200 an das Hyaluronat gebundene Spermatozoen ausgewählt und nach Kopfvakuolen bei 6000-facher Vergrößerung ausgewertet. Das Bewertungssystem für die Bewertung jedes Spermatozoons basierte auf der folgenden Klassifizierung von Vanderzwalmen . Entsprechend der Anzahl der Vakuolen und ihrer Größe wurden Spermatozoen in folgende Klassen eingeteilt: Klasse I: Fehlen von Vakuolen, Klasse II: maximal zwei kleine Vakuolen, Klasse III: mehr als zwei kleine Vakuolen oder mindestens eine große Vakuole und Klasse IV: große Vakuolen in Verbindung mit abnormalen Kopfformen oder anderen Anomalien. In jeder Spermienprobe wurden die Anteile der Spermatozoen der Klassen I, II, III und IV bewertet. Für die Statistik wurden die Anteile der Spermatozoen der Klassen I und II zu einer Gruppe „gutes Sperma“ und die Anteile der Spermien der Klassen III und IV zu einer Gruppe „schlechtes Sperma“ in 3 Spermienkopfvakuolen zusammengefasst.

2.3. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Um die ultrastrukturellen Eigenschaften von Vakuolen im Spermienkern zu beschreiben, wurden ausgewählte Spermienproben bei 500 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Überstände wurden vorsichtig entfernt und Pellets in 2,5% Glutaraldehyd und 1% Paraformaldehyd in 0 fixiert.1 M PB (Sörensen-Phosphatpuffer), pH 7,0 für 24 h bei 4°C, nachfixiert mit 1% OsO4 in 0,1 M PB für 1,5 h und eingebettet in Agar 100 Harz (Agar Scientific). Ultradünne Schnitte wurden mit 4% iger Wasserlösung von Uranylacetat und Reynolds-Bleicitrat gefärbt. Die Proben wurden mit dem Elektronenmikroskop Philips CM 100 (FEI, Niederlande) bei 80 kV untersucht; Bilder wurden mit Bioscan 792 und Orius 200 Kamera (Gatan) unter Verwendung von Digital Micrograph, Software (Gatan Inc., Washington, DC, USA) bei Vergrößerungen von 1100 bis 92000 mal.

2.4. Statistische Analyse

Die statistische Signifikanz der Unterschiede in den Prozentsätzen der Spermien mit Spermienkopfvakuolen und das Ergebnis der In-vitro-Fertilisation (Schwangerschaftsrate) zwischen den normalen Spermienproben und Proben mit abnormaler Morphologie (Teratozoospermie) wurden durch Chi-Quadrat-Test bewertet. Die Prozentsätze der „guten Spermien“ (Klasse I und Klasse II), „schlechten Spermien“ (Klasse III und Klasse IV) und der Spermien der Klassen I, II, III und IV in Bezug auf die Spermienkopfvakuolen wurden mit klassischen Parametern der Samenqualität (Konzentration, Motilität und Morphologie) korreliert), männliche Faktoren (Samenvolumen, Leukozytospermie, Alter, Größe, Gewicht und Body-Mass-Index) und das Ergebnis der In-vitro-Fertilisation (Befruchtung, Blastozysten- und Schwangerschaftsraten) unter Verwendung der Spearmanschen Rho-Korrelation. Für das Ergebnis der In-vitro-Fertilisation wurden die Daten für die gesamten In-vitro-Fertilisationszyklen und getrennt für die klassische In-vitro-Fertilisation (IVF) und die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ausgewertet. Die Schwangerschaftsabhängigkeit von weiblichen und männlichen Faktoren (einschließlich Spermienkopfvakuolen) wurde durch multivariate logistische Regression bewertet. Die statistische Signifikanz wurde festgelegt auf .

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Untersuchung der Morphologie beweglicher Spermien (MSM)

3.1.1. Spermienkopfvakuolen wie durch Lichtmikroskopie von MSM

Sowohl in den normalen als auch in den abnormalen Spermienproben wurden die Vakuolen in verschiedenen Teilen des Kopfes der Spermatozoen lokalisiert. Sie wurden als Oberflächenkonkavitäten oder hellere durchscheinende Bereiche verschiedener Größen und Zahlen gesehen. In der Literatur werden die Spermienkopfvakuolen als Oberflächenkonkavitäten, taschenartige Kernkonkavitäten oder nukleare Daumenabdrücke unter dem Lichtmikroskop beschrieben. In unserer Studie zeigte das MSOME unter Verwendung der Nomarski DIC-Mikroskopie bei 6000-facher Vergrößerung Spermienkopfvakuolen als Oberflächenkonkavitäten (Abbildung 1). Wir müssen jedoch berücksichtigen, dass die Nomarski DIC-Mikroskopie aufgrund der Brechung von Licht, das durch die Probe unterschiedlicher Dicke und optischer Dichte hindurchtritt, zu einem Pseudo-3D-Bild führt. Daher ist es möglich, dass Kernbereiche unterschiedlicher optischer Dichte nicht nur Konkavitäten, sondern auch unregelmäßige Ausbuchtungen an der Zelloberfläche sind.

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Abbildung 1

Spermien mit Kopfvakuolen in normozoospermischen ((a), (c) und (e)) und teratozoospermischen ((b), (d) und (f)) Proben beobachtet mit DIC-Mikroskopie (Nomarski) bei 6000-facher Vergrößerung.

3.1.2. Spermienkopfvakuolen, klassische Parameter der Spermienqualität und männliche Faktoren

Unsere Daten zeigen, dass Spermienkopfvakuolen sowohl in normalen als auch in abnormalen Spermienproben vorhanden waren (Abbildung 1). Interessanterweise gab es einen relativ hohen Anteil (74,6%) von Spermatozoen mit Spermienkopfvakuolen in den Spermien normaler Qualität, was darauf hindeutet, dass die Spermienkopfvakuolen auch bei normospermischen Männern gefunden werden (Tabelle 1). Obwohl bei Männern mit Teratozoospermie ein höherer Anteil an Spermatozoen mit Kopfvakuolen auftrat als bei Männern mit normaler Spermienqualität (90, 2% gegenüber 74, 6%; ), wie in Tabelle 1 ersichtlich, ist es nicht ausgeschlossen, dass Spermienkopfvakuolen auch mit der Spermienpathologie bei diesen Männern zusammenhängen können. Darüber hinaus gab es im Sperma von Männern mit Teratozoospermie einen signifikant geringeren Anteil optimaler Spermatozoen der Klasse I und einen höheren Anteil minderwertiger Spermien der Klassen III und IV als in Proben normaler Spermien (Tabelle 1)

Einige frühere Studien berichteten jedoch über höhere Prozentsätze vakuolisierter Spermatozoen bei subfertilen Männern mit normalen Samenparametern von 97,7% bis 98,4% . Diese Diskrepanz spiegelt die Tatsache wider, dass die subfertilen Männer mit normaler Samenqualität, die jedoch in das In-vitro-Fertilisationsprogramm aufgenommen wurden, eine heterogene Population von Männern darstellen, von fruchtbaren Partnern unfruchtbarer Frauen bis zu Männern mit wiederholt schlechtem Ergebnis der In-vitro-Fertilisation trotz normaler Samenqualität. Darüber hinaus gibt es verschiedene Gewohnheiten, Lebensstile und Gesundheitszustände (z. B. Entzündungen und Varikozelen), die ihre Spermien in Bezug auf Kopfvakuolen beeinflussen können. Es bestand eine positive Korrelation zwischen dem Anteil „guter Spermien“ (Klasse I und Klasse II) in Bezug auf Kopfvakuolen und Spermienkonzentration und Spermienmorphologie (Prozentsatz normaler Spermien) bei Männern, die in diese Studie einbezogen wurden, wie in Tabelle 2 ersichtlich.

Darüber hinaus bestand eine positive Korrelation zwischen dem Anteil der Spermien der Klasse I und der Spermienkonzentration, Motilität und Morphologie. Andererseits bestand eine negative Korrelation zwischen dem Anteil „schlechter Spermien“ (Klasse III und Klasse IV) in Bezug auf Kopfvakuolen und Spermienkonzentration und -morphologie (Tabelle 2). Darüber hinaus korrelierten die Anteile der Spermien der Klassen III und IV negativ mit der Spermienmorphologie und die Anteile der Spermien der Klasse IV ebenfalls negativ mit der Spermienmotilität. Alle diese Daten deuten darauf hin, dass Spermienkopfvakuolen mit einer beeinträchtigten Spermienqualität zusammenhängen, obwohl sie auch in normalen Spermienproben vorhanden waren. Dieser Befund stimmt mit einigen früheren Studien überein .

Interessanterweise gab es eine signifikante negative Korrelation zwischen dem männlichen Alter und der Konzentration der Spermien, während wir keine Korrelation zwischen den Spermienkopfvakuolen und männlichen Faktoren wie Alter, Größe, Gewicht und Body-Mass-Index beobachteten (Tabelle 3).

Wir fanden auch keine signifikante Korrelation zwischen Samenvolumen oder Leukozytospermie und Spermienkopfvakuolen. Auf der anderen Seite gab es mehr frühere Studien, die zeigten, dass einige dieser männlichen Faktoren einen Einfluss auf die Spermienqualität und die Bildung von Kopfvakuolen haben können . Eine dieser Studien zeigte, dass ein erhöhtes männliches Alter und ein erhöhter Body-Mass-Index mit erhöhten Spermienkopfvakuolen zusammenhängen, dies kann jedoch durch eine höhere Ejakulationsfrequenz und eine kürzere sexuelle Abstinenz bei diesen Männern kompensiert werden . Dies bedeutet, dass einige andere noch unbekannte männliche Faktoren das Auftreten von Spermienkopfvakuolen beeinflussen.

3.1.3. Spermienkopfvakuolen und das Ergebnis der In-vitro-Fertilisation

Die in die Studie einbezogenen Männergruppen unterschieden sich nicht hinsichtlich des Durchschnittsalters der Partnerinnen und der Anzahl der Eizellen pro Frau, den wichtigsten weiblichen Faktoren, die das Ergebnis der In-vitro-Fertilisation beeinflussen können (Tabelle 4). Die Schwangerschaftsraten bei teratozoospermischen und normozoospermischen Männern betrugen 32,5% und 26,8% (siehe Tabelle 4).

Bei näherer Betrachtung wurde deutlich, dass der Anteil an „guten Spermien“ oder „schlechten Spermien“ in Bezug auf Kopfvakuolen in Samenproben auf einen Anteil befruchteter Eizellen (Befruchtungsrate) nach In-vitro-Fertilisationsverfahren hinwies, dies hing jedoch von der Methode der In-vitro-Fertilisation ab. Nach der klassischen In-vitro-Fertilisation (IVF) bestand eine signifikante positive Korrelation zwischen dem Anteil „guter Spermien“ in der Samenprobe und der Befruchtungsrate (Tabelle 5). Auf der anderen Seite gab es eine negative Korrelation zwischen dem Anteil an „schlechtem Sperma“ und der Befruchtungsrate, wie in Tabelle 5 zu sehen ist.

Aus Abbildung 2 ist ersichtlich, dass in Samenproben mit mehr als ~ 50% „schlechtem Sperma“ in Bezug auf Spermienkopfvakuolen die Befruchtungsrate verringert wurde. Interessanterweise beobachteten wir keine Korrelation zwischen Spermienkopfvakuolen und Befruchtungsrate nach intrazytoplasmatischer Injektion (ICSI), wie in einigen früheren Studien festgestellt . Dies deutet darauf hin, dass Spermienkopfvakuolen einige physiologische Prozesse von Spermatozoen beeinträchtigen können, die für die klassische In-vitro-Fertilisation durch Insemination benötigt werden, wie z. B. Kapazität, Akrosomenreaktion, Spermienbindung an Zona pellucida oder dass eine weitere Spermienselektion durch ICSI durchgeführt wird.

Abbildung 2

Beziehung zwischen Spermienkopfvakuolen (Anteil schlechter Spermien: Klasse II plus Klasse III) in Samenproben und Befruchtungsrate der Eizellen nach klassischer In-vitro-Fertilisation (IVF).

In Bezug auf die Blastozystenrate gab es eine negative Korrelation () zwischen dem Prozentsatz der Spermatozoen der Klasse III in Samenproben und der Blastozystenrate nach klassischer In-vitro-Fertilisation, während wir keine anderen Korrelationen beobachteten. Wir haben keine Korrelation zwischen Spermienkopfvakuolen und Schwangerschaftsrate beobachtet, unabhängig von der Methode der In-vitro-Fertilisation. Es gab eine positive Beziehung zwischen der Schwangerschaft und der Anzahl der Eizellen, die bei der weiblichen Partnerin entnommen wurden, wie durch den Mann-Whitney-Test gezeigt, aber wir fanden keine Beziehung zwischen Schwangerschaft und Spermienkopfvakuolen. Dies wurde durch multivariate logistische Regression unter Berücksichtigung weiblicher und männlicher Faktoren einschließlich Spermienkopfvakuolen weiter bestätigt.

Die meisten früheren Studien haben versucht, die Wirkung von Spermienkopfvakuolen auf das Ergebnis der ICSI bei Männern mit schlechter Samenqualität aufzuklären, und einige von ihnen bestätigten tatsächlich den negativen Effekt . Der Vorteil unserer Studie ist, dass wir die Wirkung von Samenkopfvakuolen nicht nur auf das Ergebnis der ICSI in Samenproben von schlechter Qualität (Teratozoospermie), sondern auch auf das Ergebnis der klassischen IVF in normalen Samenproben (mit normalen klassischen Parametern der Samenqualität, einschließlich Morphologie). Unsere Daten zeigen, dass die Spermienkopfvakuolen für das Ergebnis der klassischen IVF noch schädlicher waren als für die ICSI.

3.2. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Ähnlich wie bei MSE zeigte die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) die Spermienkopfvakuolen in normalen und abnormalen Spermienproben. Die Vakuolen in Spermienköpfen wurden als hellere Bereiche innerhalb des Kerns gesehen und waren in fast allen Spermatozoen in beiden Arten von Spermienproben vorhanden (Abbildungen 3 (a) und 3 (b)). Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Spermienkopfvakuolen werden in der Literatur selten präsentiert und die Interpretation ihrer Ultrastruktur ist knapp . Die Beschreibung der Feinstruktur menschlicher Spermatozoen zeigt normalerweise große klare Bereiche in Spermienköpfen als Vakuolen und kleinere klare Bereiche als Nukleoplasma oder klare Flecken .

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Abbildung 3

Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen (TEM) von normozoospermischen Proben mit Kopfvakuolen unterschiedlicher Größe und Position. Pfeil zeigt Vakuolen auf (b), (c) und RNE in (d). A: Akrosom, N: Kern, M: Mitochondrien und RNE: redundante Kernhülle.

Im Gegensatz zu lichtmikroskopischen Aufnahmen, bei denen Vakuolen als Oberflächenkonkavitäten gesehen werden, wurden in elektronenmikroskopischen Aufnahmen Vakuolen gelegentlich als Ausbuchtungen an der Zelloberfläche beobachtet (Abbildung 3 (c)). Aufgrund der unterschiedlichen optischen Dichte von Vakuolen und kondensiertem Chromatin erscheinen mit Membranen gepackte Kerneinbuchtungen unter Lichtmikroskopie als Oberflächenkonkavitäten.

3.2.1. Ultrastrukturelle Merkmale von Spermienkopfvakuolen

Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Spermienkopfvakuolen zeigten Kerneinbuchtungen mit Membranstapeln (Abbildungen 4 (c), 4 (d) und 4 (f)). Diese Membranen waren als konzentrisch angeordnete Lamellen organisiert und werden als Membranwirtel (MW) bezeichnet, die sich gelegentlich von der Zelloberfläche ausbeulen. Membranwirtel verschiedener Komplexität waren in verschiedenen Bereichen des Spermienkerns vorhanden und können sowohl in morphologisch normalen als auch in abnormalen Spermatozoen einen großen Bereich des Kerns einnehmen. In fast allen Fällen waren Membranwirtel von intaktem Akrosom und intakter Plasmamembran bedeckt (Abbildungen 4 (c) und 4 (d)). Sie bestanden größtenteils aus dicht gepackten Doppelmembranen mit elektronendichten Molekülsepten und dünneren Membranen, die flockiges Material einschlossen (Abbildungen 4 (d) und 4 (f)). Franklin und Fussell beobachteten Membranwirtel im apikalen subakrosomalen Raum von Spermatiden des späten Hamsters, die mit der Kernhülle kontinuierlich waren. Den Autoren zufolge erschienen die Membranwirtel größer und waren in der End- oder Reifungsphase der Spermiogenese in größerer Zahl vorhanden.

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Abbildung 4

TEM-Mikroaufnahmen von Spermienkopfvakuolen von Normozoospermie ((a), (c), (d), (e) und (f)) und Teratozoospermie (b). (a) Kerneinbuchtungen mit Membranen, die flockiges Material einschließen (Sternchen). Doppelmembran mit molekularen Septen (Pfeil), die aus der Kernhülle austreten. (b) Kern mit klaren Flecken von nicht kondensiertem Chromatin (Pfeil) und großer Fläche mit flockigem Material (Sternchen). c) Membranwirtel (MW), die aus konzentrisch angeordneten Membranen bestehen. (d) Hohe Vergrößerung von Membranwirbeln von (c). (e) Membranwirtel (MW), die einen großen Teil des Kerns einnehmen. (f) Hohe Vergrößerung von Doppelmembranen mit Septumkomplexen (Pfeil) und dünnen Membranen (Pfeilspitze). A: Akrosom; N: Kern.

Die Reifung der Spermien führt zu einer Reorganisation des Kerns und einer Verringerung seiner Größe. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Kernreifung eine Reduktion der Kernhülle beinhaltet, einer dynamischen Doppelmembran, die den Kern umgibt, Chromosomen trennt und den Kerntransport durch Poren reguliert . Viele Details seiner Transformation sind noch unklar. Unsere mikroskopischen Aufnahmen von Membranwirbeln zeigten Kontinuität der Membranen mit der Kernhülle (Abbildungen 5 (a) und 5 (c)). Membranstrukturen mit septierten elektronendichten Molekülkomplexen werden wahrscheinlich während der Reorganisation der Kernhülle erzeugt. Diese Strukturen wurden von mehreren Autoren als redundante Kernhülle (RNE) beschrieben . Die RNE ist in unserer mikroskopischen Aufnahme normaler Spermatozoen zu sehen (Abbildung 3 (d)).

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Abbildung 5

Querschnitte von Spermatozoen in normozoospermischen Proben ((a), (b) und (c)) mit großen Kerneinbuchtungen mit Membranwirbeln (MW). Die Akrosomenmembran ist mit der Kernhülle verbunden (Pfeile). (c) Membranwirtel (MW) mit zusätzlichen Membranen zwischen Kern und Akrosom (Pfeilspitze). (d) Großer Teil des nicht kondensierten Chromatins mit körniger Bildung im Kern (Pfeil) des Spermatozoons mit abnormaler Morphologie. A: Akrosom, N: Kern und C: Zytoplasma.

Verschiedene Stadien der Chromatinkondensation sind in unseren mikroskopischen Aufnahmen in allen Proben zu sehen. In Abbildung 5 (d) sehen wir ein Spermatozoon mit abnormaler Morphologie in einem Prozess der Chromatinkondensation, der immer noch von einer großen Menge Zytoplasma umgeben ist. In der späten Spermatogenese wird die Spermien-DNA dicht gepackt, da Histone durch Protamine ersetzt werden . Kondensationsfehler treten jedoch häufig auf und führen zu unregelmäßig geformten lichten Räumen unterschiedlicher Größe im Kern . Es ist bekannt, dass ein Versagen der Chromatinkondensation mit dem Vorhandensein kleiner und großer Vakuolen verbunden ist . Unsere mikroskopischen Aufnahmen zeigten kleinere elektronendurchlässige Bereiche von nicht kondensiertem Chromatin und Kernvakuolen, die sich in ihrer Größe unterscheiden und immer amorphes Material oder / und Membranwirtel enthalten. Sie können stärker in Spermatozoen teratozoospermischer Proben exprimiert werden und können mit abnormalen Spermienreifungsprozessen und Spermienkopfvakuolen zusammenhängen. Es ist jedoch eine gezieltere Forschung erforderlich.

Das Akrosom war in den meisten Spermatozoen mit Spermienkopfvakuolen vollständig entwickelt. In einigen Zellen wurden Verbindungen der inneren akrosomalen Membran und der Kernhülle beobachtet (Abbildungen 5 (a) und 5(b)). Die Akrosomenmorphogenese ist ein dynamischer Prozess, der eine enge Wechselwirkung zwischen dem Golgi-Komplex und der Kernhülle des frühen Spermatids beinhaltet. Es wurde gezeigt, dass die perinukleäre Theca (PT) eine Zytoskelettstruktur ist, die den Spermienkern bei Säugetieren bedeckt und nachweislich eine wichtige Rolle bei der normalen Akrosomenbildung spielt .

Wie von Setti et al. einige Autoren berichten, dass Spermienvakuolen akrosomalen Ursprungs sind und nicht reagiertes Akrosom widerspiegeln . Ein negativer Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von Vakuolen und der Fähigkeit der Spermien, die akrosomale Reaktion zu durchlaufen, wird aufgedeckt. Unsere Daten zeigen, dass die Samenkopfvakuolen einzigartige Strukturen sind, die normalerweise von intaktem Akrosom bedeckt sind.

Abnormale Spermatozoen waren in beiden Arten von Spermienproben vorhanden – normal und abnormal. Anomalien betrafen verschiedene Komponenten der Samenzellen, nämlich Chromatin, Akrosom, Halsregion, Mitochondrien und Schwanz. Wir präsentieren mehrere mikroskopische Aufnahmen abnormaler Spermatozoen aus normozoospermischen Proben mit weniger kondensiertem Chromatin, gebogenem Hals, atypischem Akrosom und abnormaler Kopfform (Abbildung 6).

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Abbildung 6

( a), (b), (c) und (d) Spermatozoen aus normalen Spermienproben mit abnormaler Morphologie. Chromatin ist körnig und weniger kondensiert mit zahlreichen klaren Flecken (weiße Pfeile). Das Akrosom ist abnormal gebildet (a), teilweise gebildet (d) und manchmal mit Membranwirbeln verbunden (b). (c) Gebogene Halsregion. A: Akrosom; N: Kern.

3.2.2. Funktion der Spermienkopfvakuolen

Derzeit ist es unmöglich zu sagen, was die eigentliche Funktion der Spermienkopfvakuolen ist. Basierend auf unseren mikroskopischen Aufnahmen der Spermienultrastruktur schlagen wir vor, dass Spermienkopfvakuolen eine Substanz unbekannten Ursprungs aus Chromatin entfernen können. Da sie die mögliche Beziehung sowohl zum Spermienreifungsprozess auf der einen Seite als auch zur abnormalen Chromatinkondensation auf der anderen Seite anzeigen, kann man spekulieren, dass die Spermienkopfvakuolen an der Entfernung von Histonen beteiligt sein können, wenn sie durch Protamine ersetzt werden. Für eine Schlussfolgerung ist es jedoch noch zu früh, und weitere Untersuchungen sind erforderlich.

4. Schlussfolgerungen

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass Spermienproben von Männern mit Teratozoospermie durch ein erhöhtes Verhältnis von Spermienkopfvakuolen gekennzeichnet sind, obwohl sie auch in Spermienproben normospermischer Männer vorhanden sind. Dies deutet darauf hin, dass sie mit dem pathologischen Zustand zusammenhängen können. Unsere mikroskopischen Aufnahmen der Spermienultrastruktur zeigen, dass Spermienkopfvakuolen aus Membranwirbeln bestehen. Variationen der Chromatinkondensation wurden hauptsächlich in abnormalen Spermienproben beobachtet, und es ist nicht ausgeschlossen, dass sie mit der abnormalen Reifung und den Spermienkopfvakuolen zusammenhängen. Weitere Forschungen, die verschiedene Methoden und Transmissionselektronenmikroskopie kombinieren, sind erforderlich, um dieses Phänomen besser aufzuklären.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt in Bezug auf die Veröffentlichung dieser Arbeit haben.

Danksagung

Die Autoren danken den klinischen Embryologen des IVF-Labors Ljubljana, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Universitätsklinikum Ljubljana, für die Vorbereitung des Samens und des Labors für Elektronenmikroskopie der Abteilung für Biologie, Biotechnische Fakultät, Universität Ljubljana.