kliniske og strukturelle træk ved Sædhovedvakuoler hos mænd inkluderet i In Vitro Fertiliseringsprogrammet

abstrakt

de humane sædhovedvakuoler og deres rolle i mandlig infertilitet er stadig dårligt forstået. Formålet med denne undersøgelse var at identificere de kliniske og ultrastrukturelle træk ved humane sædhovedvakuoler hos mænd inkluderet i In vitro-befrugtningsprogrammet: mænd med normal (normosoospermi) og nedsat sædmorfologi (teratosospermi). Sædprøverne blev observeret under 6000 gange forstørrelse ved hjælp af motile sperm organelle morfologi undersøgelse (MSOME). Andelen af sæd med hovedvakuoler blev evalueret og relateret til resultatet af in vitro befrugtning. Sæd hos mænd med nedsat sædmorfologi var kendetegnet ved en højere andel af sædhovedvakuoler. Sædhovedvakuolerne var relateret til nedsat sædkvalitet (sædkoncentration, motilitet og morfologi), men blev ikke påvirket af mandlige faktorer (sædvolumen, højde, alder, vægt eller kropsmasseindeks). Desuden var sædhovedvakuoler relateret til nedsat befrugtningshastighed kun efter klassisk in vitro befrugtning (IVF), mens der ikke var nogen relation til graviditet. I en undergruppe af mænd blev sædcellerne fikseret og observeret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM). Den ultrastrukturelle undersøgelse afslørede, at sædhovedvakuoler er store nukleare indrykkninger i forskellige størrelser og positioner, pakket med membranøst materiale organiseret i membranhvirvler.

1. Introduktion

mandlig infertilitet kan relateres til unormal morfologi af sædceller. I de sidste år har der været meget debat om en ny potentiel parameter for sædkvalitet og mandlig fertilitet, sædhovedvakuoler. På trods af det er de menneskelige sædhovedvakuoler og deres potentielle rolle i mandlig infertilitet stadig dårligt forstået.

ved hjælp af motile sperm organelle morfologi undersøgelse (MSOME), hvor levende sædceller visualiseres med DIC Nomarski mikroskopi ved forstørrelse på 6000 gange, er nogle fine morfologiske strukturer synlige, som kan være nyttige til at bestemme sædkvaliteten. Denne metode viser små og større overfladekonkaviteter betegnet sædvakuoler, normalt placeret i hovedet på sædceller. Arten og oprindelsen af sædhovedvakuoler er stadig usikker, og det er ikke klart, om de stammer fra kernen eller akrosomet eller andre membranøse strukturer. Vakuoler findes også i næsten alle prøver med normal sædmorfologi (>14% morfologisk normal sæd i henhold til Krugers strenge kriterier) og er hovedsageligt placeret i spidsen eller det midterste område af sædhoveder . De tredimensionelle dekonvolutionsbilleder, der detekterer DNA, viste vakuoler som “nukleare konkaviteter”, og atomkraftmikroskopi afslørede intakt, men let nedsænket plasmamembran i området med vakuoler . Desuden viste elektronmikroskopbillederne af sædprøver hos patienter med unormal sædmorfologi, teratosoospermi (<14% normal sæd i prøven ifølge Krugers strenge kriterier) vakuoler udelukkende inden for sædkernen . Den forreste placering af sædhovedvakuoler førte til spørgsmålet om deres mulige oprindelse fra akrosom. Induktionen af akrosomreaktion af ionophore a23587, follikelvæske og hyaluronsyre reducerede procentdelen af sædceller med hovedvakuoler, hvilket antydede, at de kunne være relateret til akrosomet. Imidlertid er vakuoler også til stede i sædprøverne uden akrosom (dvs .globosospermi), hvilket antyder, at de ikke stammer fra akrosom. Det blev vist, at prøver med store sædhovedvakuoler (mere end 13% af hovedoverfladen) har højere procentdel af fragmenteret DNA sammenlignet med dem med små vakuoler såvel som højere frekvens af kromosomafvigelser . Sædhovedvakuolerne observeret under den høje forstørrelse af lysmikroskopi blev beskrevet som “lommelignende” nukleare konkaviteter relateret til svigt i kromatinkondensation . Tværtimod fandt nogle forskere ingen sammenhæng mellem de store sædhovedvakuoler og DNA-skader eller kromosomafvigelser . Sædkernemodelleringen under spermiogenese involverer nukleoproteiner, mikrotubulær manchette og perinukleært materiale, som er kendt for at deltage i akrosomforankringen på kernen og også udgør den perinukleære theca . Under spermiogenese reduceres kernen markant, og nukleosomerne forekommer normalt ikke tilfældigt fordelt over hele genomet. Det nukleosombundne DNA kan forblive samlet med nuklear Matrice og ses som “tomt rum” i elektroniske billeder. Sammen kunne de have en vigtig rolle i faderlig kromatinstruktur efter befrugtning . I de sene trin af spermiogenese bliver det nukleare DNA stærkt kondenseret, fordi nukleoproteinerne histoner erstattes af protaminer . Under udskiftning af nukleoproteiner dannes og nedbrydes mange midlertidigt funktionelle proteiner i særlige nedbrydningssteder. De nukleare lommer i bunden af sædhovedet blev foreslået at fungere som proteolytiske Centre og udgangsstedet, hvorfra proteinresterne forlader kernen og kan være funktionelt forbundet med vakuoler .

sædhovedvakuolerne er en interessant, men dårligt forstået parameter for sædkvalitet og mandlig fertilitet, som synes at være relateret til resultatet af in vitro befrugtning hos mænd med nedsat sædkvalitet . Oprindelsen og dynamikken i sædhovedvakuoler forstås ikke godt, og deres rolle i sædfunktionen er omstridt. Nogle forfattere antyder , at sædvakuoler er normale træk ved sædhoved, mens andre beskriver dem som degenerative strukturer relateret til mandlig subfertilitet . Derfor var formålet med denne undersøgelse at evaluere procentdelene af sæd med hovedvakuoler i både de normale sædprøver og prøver med nedsat sædmorfologi og at relatere dem til resultatet af in vitro befrugtning. Desuden blev ultrastrukturen og funktionen af sædhovedvakuoler genovervejet i forhold til sædmodning ved anvendelse af den høje opløsning af transmissionselektronmikroskopi.

2. Materialer og metoder

i denne undersøgelse blev sædprøverne på 81 mænd inkluderet i In vitro-befrugtningsprogrammet undersøgt: 40 mænd med normal sædmorfologi og 41 mænd med unormal sædmorfologi (teratosoospermi) i henhold til Krugers strenge kriterier (unormal: < 14% normal sæd). Sædprøverne blev fremstillet og anvendt til in vitro befrugtning. Hver sædprøve blev fremstillet ved centrifugering (300 g) i 20 minutter på 100%/40% densitetsgradient af PureSperm (NidaCon, Sverige) efterfulgt af svømmeteknikken, hvor de bedste sædceller blev ekstraheret fra prøven. Alle normale sædprøver blev brugt til klassisk in vitro befrugtning (IVF), mens prøverne med unormal sædmorfologi blev brugt til intracytoplasmatisk sædinjektion (ICSI) til at befrugte den kvindelige partners oocytter. Prøverne, som forblev efter in vitro befrugtning, blev anvendt til motile sperm organelle morfologi undersøgelse (MSOME) for at evaluere procentdelen af sædhovedvakuoler i hver prøve under 6000-tidsforstørrelse. Procentdelene af sæd med hovedvakuoler og resultatet af in vitro befrugtning blev sammenlignet mellem de normale og unormale sædprøver. Ved anvendelse af den høje opløsning af transmissionselektronmikroskopi (TEM) blev ultrastrukturen af 10 prøver af normosospermiske mænd og 6 prøver af teratosospermiske mænd observeret. Den potentielle funktion og struktur af vakuoler blev søgt, også i forhold til sædmodningsproces.

denne forskning blev godkendt af National Medical Ethics Committee.

2.1. Klassiske parametre for sædkvalitet

de klassiske parametre, sædkoncentration og motilitet og morfologi for hver sædprøve blev evalueret. Sædprøven skulle være normal ved koncentration på 15 millioner sædceller pr. mL og på 40% Total (progressiv og nonprogressiv) motile sædceller i henhold til hvem-kriterierne og på 14% af morfologisk normale sædceller i henhold til Krugers strenge kriterier.

2.2. Motile Sperm Organelle morfologi undersøgelse (MSOME)

til motile sperm organelle morfologi undersøgelse, vi brugte dråber af Spermslavt medium (Origio, Danmark) i en glasbundet skål (Gvst1000; Vil Co, brønde, Amsterdam, Holland) og dråber af sædprøve fremstillet ved svømmeteknik, tidligere beskrevet af knes . Sædcellerne i hver prøve blev overvåget under et omvendt mikroskop med et opvarmet trin udstyret med differentiel interferenskontrast (Eclipse TE2000-s; Nikon, Japan). En tynd, langstrakt sæddråbelavt medium (Origio, Danmark) blev anbragt på bunden af en glasskål. En mindre dråbe fremstillet sæd blev anbragt i nærheden af Sædenlav dråbe og sæd bundet til hyaluronat. Alle dråber blev dækket af paraffinolie for at forhindre tørring af sædprøven. Til observation under 6000 forstørrelse blev en dråbe nedsænkningsolie indsat under glasskålen (under Sæddråben). En dråbe sæd med bundet sæd blev overvåget af nedsænkningsmålet, differentiel interferenskontrast og et Nikon Digital Sight DS-Ri1 kamera. I hver prøve blev 200 sædceller bundet til hyaluronatet valgt og evalueret i henhold til hovedvakuoler ved 6000-tidsforstørrelse. Scoringssystemet til evaluering af hver sædcelle var baseret på følgende klassificering af vandrere . I henhold til antallet af vakuoler og deres størrelse blev sædceller klassificeret i følgende: klasse i: fravær af vakuoler, klasse II: maksimalt to små vakuoler, klasse III: mere end to små vakuoler eller mindst en stor vakuol og klasse IV: store vakuoler i forbindelse med unormale hovedformer eller andre abnormiteter. I hver sædprøve blev proportionerne af klasse i, klasse II, klasse III og klasse IV sædceller evalueret. Til statistik blev proportionerne af sæd i klasse I og klasse II kombineret i en gruppe, “god Sæd” og proportionerne af klasse III og klasse IV sæd i en gruppe, “dårlig sæd”, i 3 termer af sædhovedvakuoler.

2.3. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)

for at beskrive de ultrastrukturelle egenskaber ved vakuoler i sædkernen blev valgte sædprøver centrifugeret ved 500 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanter blev forsigtigt fjernet, og pellets blev fikseret i 2,5% glutaraldehyd og 1% paraformaldehyd i 0.1 M PB (s-Kurrrensens phosphatbuffer), pH 7,0 for 24 timer ved 4-kur C, postfastgjort med 1% OsO4 i 0,1 M PB for 1,5 timer og indlejret i Agar 100-harpiks (agar videnskabelig). Ultratynde sektioner blev farvet med 4% vandopløsning af uranylacetat og Reynolds blycitrat. Prøver blev undersøgt med Philips CM 100 elektronmikroskop (FEI, Holland), der opererer ved 80 kV; billeder blev optaget med Bioscan 792 og Orius 200 kamera (Gatan) ved hjælp af Digital Mikrograf, program (Gatan Inc. I forstørrelser fra 1100 til 92000 gange.

2.4. Statistisk analyse

den statistiske signifikans af forskelle i procentdelene af sæd med sædhovedvakuoler og resultatet af in vitro-befrugtning (graviditetsrate) mellem de normale sædprøver og prøver med unormal morfologi (teratosoospermi) blev evalueret ved chi-firkantet test. Procentdelene af “god Sæd” (klasse I og klasse II), “dårlig sæd” (klasse III og klasse IV) og klasse i, klasse II, klasse III og klasse IV sæd med hensyn til sædhovedvakuoler var korreleret med klassiske parametre for sædkvalitet (koncentration, motilitet og morfologi), mandlige faktorer (sædvolumen, leukocytospermi, alder, højde, vægt og kropsmasseindeks) og resultatet af in vitro befrugtning (befrugtning, blastocyst og graviditetsrater) ved hjælp af Spearmans rho-korrelation. For resultatet af in vitro-befrugtning blev dataene evalueret for samlede in vitro-befrugtningscyklusser og separat for klassisk in vitro-befrugtning (IVF) og intracytoplasmisk sædinjektion (ICSI). Graviditetsafhængigheden af kvindelige og mandlige faktorer (inklusive sædhovedvakuoler) blev evalueret ved multivariat logistisk regression. Den statistiske signifikans blev fastsat til .

3. Resultater og diskussion

3.1. Motile Sperm Organelle morfologi undersøgelse (MSOME)

3.1.1. Spermhovedvakuoler som det ses ved lysmikroskopi af MSOME

i begge normale og unormale sædprøver var vakuolerne placeret i forskellige dele af sædhovedet. De blev set som overfladekonkaviteter eller lettere gennemskinnelige områder i forskellige størrelser og tal. I litteraturen beskrives sædhovedvakuolerne som overfladekonkaviteter, lommelignende nukleare konkaviteter eller nukleare tommelfingeraftryk under lysmikroskopet. I vores undersøgelse viste MSOME ved hjælp af Nomarski DIC-mikroskopi ved 6000-tidsforstørrelse sædhovedvakuoler som overfladekonkaviteter (Figur 1). Vi må dog tage højde for, at Nomarski DIC-mikroskopi resulterer i et pseudo-3D-billede på grund af brydning af lys, der passerer gennem prøven med forskellig tykkelse og optisk densitet. Derfor er det muligt, at nukleare regioner med forskellig optisk densitet ikke kun er konkaviteter, men også uregelmæssige buler ved celleoverfladen.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Figur 1

sæd med hovedvakuoler i normosospermiske ((A), (c) og(e)) og teratosospermiske ((b), (d) og (f)) observerede prøver med DIC mikroskopi (Nomarski) ved 6000-tiden forstørrelse.

3.1.2. Sædhovedvakuoler, klassiske parametre for sædkvalitet og mandlige faktorer

vores data viser, at sædhovedvakuoler var til stede i både de normale og unormale sædprøver (Figur 1). Interessant nok var der en relativt høj andel (74,6%) af sædceller med sædhovedvakuoler i sæd af normal kvalitet, hvilket indikerer, at sædhovedvakuolerne også findes hos normospermiske mænd (tabel 1). Selvom der var en højere andel sædceller med hovedvakuoler hos mænd med teratosoospermi end hos mennesker med normal sædkvalitet (90,2% mod 74,6%; ), som det kan ses i tabel 1, er det ikke udelukket, at sædhovedvakuoler også kan være relateret til sædpatologien hos disse mænd. Desuden var der i sæd hos mænd med teratosospermi en signifikant lavere andel af optimal sæd i klasse I og en højere andel af lavkvalitets sæd i klasse III og IV end i prøver af normal sæd (tabel 1)

nogle tidligere undersøgelser rapporterede imidlertid højere procentdele af vakuoleret sæd hos subfertile mænd med normale sædparametre, der spænder fra 97,7% til 98,4% . Denne uoverensstemmelse afspejler det faktum, at de subfertile mænd med normal sædkvalitet, men inkluderet i In vitro-befrugtningsprogrammet, repræsenterer en heterogen population af mænd, fra frugtbare partnere til infertile kvinder til mænd med gentagne dårlige in vitro-befrugtningsresultater på trods af normal sædkvalitet. Derudover er der flere forskellige vaner, livsstil og sundhedsmæssige forhold (f.eks. betændelse og varicocele), der kan påvirke deres sæd i form af hovedvakuoler. Der var en positiv sammenhæng mellem andelen af “god Sæd” (klasse i og klasse II) med hensyn til hovedvakuoler og sædkoncentration og sædmorfologi (procentdel af normal sæd) hos mænd inkluderet i denne undersøgelse, som det kan ses i tabel 2.

desuden var der en positiv sammenhæng mellem andelen af sæd i klasse I og sædkoncentration, motilitet og morfologi. På den anden side var der en negativ sammenhæng mellem andelen af “dårlig sæd” (klasse III og klasse IV) med hensyn til hovedvakuoler og sædkoncentration og morfologi (tabel 2). Derudover var andelene af klasse III og klasse IV sædceller negativt korreleret med sædmorfologi, og andelene af klasse IV sædceller var også negativt korreleret med sædmotilitet. Alle disse data indikerer, at sædhovedvakuoler var relateret til nedsat sædkvalitet, skønt de også var til stede i normale sædprøver. Dette fund er i overensstemmelse med nogle tidligere undersøgelser .

interessant nok var der en signifikant negativ sammenhæng mellem den mandlige alder og koncentrationen af sæd, mens vi ikke observerede nogen sammenhæng mellem sædhovedvakuolerne og mandlige faktorer som alder, højde, vægt og kropsmasseindeks (tabel 3).

vi fandt heller ikke nogen signifikant sammenhæng mellem sædvolumen eller leukocytospermi og sædhovedvakuoler. På den anden side var der flere tidligere undersøgelser, der viste, at nogle af disse mandlige faktorer kan have indflydelse på sædkvaliteten og dannelsen af hovedvakuoler . En af disse undersøgelser viste, at øget mandlig alder og kropsmasseindeks er relateret til øgede sædhovedvakuoler, men dette kan kompenseres ved højere ejakulationsfrekvens og en kortere periode med seksuel afholdenhed hos disse mænd . Dette betyder, at nogle andre stadig ukendte mandlige faktorer påvirker udseendet af sædhovedvakuoler.

3.1.3. Spermhovedvakuoler og resultatet af in Vitro-befrugtning

de grupper af mænd, der var inkluderet i undersøgelsen, var ikke forskellige med hensyn til gennemsnitsalderen for kvindelige partnere og antallet af oocytter pr.kvinde, de vigtigste kvindelige faktorer, der kan påvirke resultatet af in vitro-befrugtning (Tabel 4). Graviditetsraterne hos teratosospermiske og normosospermiske mænd var 32,5% og 26,8% (Se tabel 4).

ved yderligere inspektion blev det klart, at andelen af “god sæd” eller “dårlig sæd” med hensyn til hovedvakuoler i sædprøver var vejledende for en andel befrugtede oocytter (befrugtningshastighed) efter in vitro-befrugtningsprocedure, men dette afhang af metoden til in vitro-befrugtning. Efter klassisk in vitro befrugtning (IVF) var der en signifikant positiv sammenhæng mellem procentdelen af “god sæd” i sædprøven og befrugtningshastigheden (tabel 5). På den anden side var der en negativ sammenhæng mellem andelen af “dårlig sæd” og befrugtningshastigheden, som det kan ses i tabel 5.

fra Figur 2 kan det ses, at i sædprøver med mere end ~50% af “dårlig sæd” med hensyn til sædhovedvakuoler blev befrugtningshastigheden nedsat. Interessant nok observerede vi ikke nogen sammenhæng mellem sædhovedvakuoler og befrugtningshastighed efter intracytoplasmisk injektion (ICSI), som det blev fundet af nogle tidligere undersøgelser . Dette indikerer, at sædhovedvakuoler kan forringe en eller anden fysiologisk proces af sædceller, der er nødvendige til klassisk in vitro-befrugtning ved insemination, såsom kapacitation, akrosomreaktion, sædbinding til en pellucida, eller at noget mere sædvalg udføres af ICSI.

figur 2

forholdet mellem sædhovedvakuoler (andel af dårlig sæd: klasse II plus klasse III) i sædprøver og oocytbefrugtningshastighed efter klassisk in vitro-befrugtning (IVF).

med hensyn til blastocysthastighed var der en negativ sammenhæng () mellem procentdelen af klasse III sædceller i sædprøver og blastocysthastighed efter klassisk in vitro befrugtning, mens vi ikke observerede andre korrelationer. Vi observerede ikke nogen sammenhæng mellem sædhovedvakuoler og graviditetsrate uanset metoden til in vitro befrugtning. Der var en positiv sammenhæng mellem graviditeten og antallet af oocytter hentet i kvindelig partner, som afsløret ved Mann-Hvidney test, men vi fandt ikke nogen sammenhæng mellem graviditet og sædhovedvakuoler. Dette blev yderligere bekræftet af multivariat logistisk regression, der respekterer kvindelige og mandlige faktorer, herunder sædhovedvakuoler.

de fleste af de tidligere undersøgelser har forsøgt at belyse effekten af sædhovedvakuoler på resultatet af ICSI hos mænd med dårlig sædkvalitet, og nogle af dem bekræftede faktisk den negative effekt . Fordelen ved vores undersøgelse er, at vi belyste effekten af sædhovedvakuoler ikke kun på resultatet af ICSI i sædprøver af dårlig kvalitet (teratosoospermi), men også på resultatet af klassisk IVF i normale sædprøver (med normale klassiske parametre for sædkvalitet, herunder morfologi). Vores data indikerer, at sædhovedvakuolerne var endnu mere skadelige for resultatet af klassisk IVF end for ICSI.

3.2. Transmissionselektronmikroskopi (tem)

tilsvarende, som ved MSOME, transmissionselektronmikroskopi (TEM) afslørede sædhovedvakuolerne i normale og unormale sædprøver. Vakuolerne i sædhoveder blev set som lettere områder inde i kernen og var til stede i næsten alle sædceller i begge typer sædprøver (figur 3(A) og 3(b)). Elektronmikrografer af sædhovedvakuoler præsenteres sjældent i litteraturen, og fortolkningen af deres ultrastruktur er knap . Beskrivelsen af den fine struktur af humane sædceller præsenterer normalt store Lucente områder i sædhoveder som vakuoler og mindre klare områder som nukleoplasma eller klare pletter .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

figur 3

Transmissionselektronmikrografer (TEM) af normosospermiske prøver med hovedvakuoler af forskellig størrelse og position. Pil angiver vakuoler på (b), (c) og RNE I (d). A: acrosom, N: nucleus, M: mitokondrier og RNE: redundant nuklear kuvert.

i modsætning til lette mikrografer, hvor vakuoler ses som overfladekonkaviteter, blev der i elektronmikrografer lejlighedsvis observeret vakuoler som buler ved celleoverfladen (figur 3(c)). På grund af forskellig optisk tæthed af vakuoler og kondenseret kromatin vises nukleare indrykk pakket med membraner som overfladekonkaviteter under lysmikroskopi.

3.2.1. Ultrastrukturelle træk ved Sædhovedvakuoler

Elektronmikrografer af sædhovedvakuoler viste nukleare indrykninger indeholdende stabler af membraner (figur 4(c), 4(d) og 4(f)). Disse membraner blev organiseret som koncentrisk arrangerede lameller og beskrives som membranhvirvler (mv), som lejlighedsvis bule ud fra celleoverfladen. Membranhvirvler med forskellige kompleksiteter var til stede i forskellige områder af sædkernen og kan optage et stort kerneområde i både morfologisk normale og unormale sædceller. I næsten alle tilfælde var membranhvirvler dækket af intakt akrosom og plasmamembran (figur 4(c) og 4(d)). De var for det meste sammensat af tætpakkede dobbeltmembraner med elektrontæt molekylær septa og tyndere membraner, der omslutter flokkuleret materiale (figur 4(d) og 4(f)). Franklin og Fussell observerede membranhvirvler i apikalt subakrosomalt rum af sen hamster spermatider, som var kontinuerlige med den nukleare konvolut. Ifølge forfatterne syntes membranhvirvlerne større og var til stede i større antal i den endelige eller modningsfase af spermiogenese.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

figur 4

tem-mikrografer af sædhovedvakuoler af normosospermi ((A), (c), (d), (e) og (f)) og teratosospermi (b). a) nukleare fordybninger med membraner, der omslutter flokkuleret materiale (asterisk). Dobbelt membran med molekylær septa (pil), der kommer ud af nuklear konvolut. (B) kerne med klare pletter af ikke-kondenseret kromatin (pil) og stort område med flokkuleret materiale (stjerne). C) Membranhvirvler bestående af koncentrisk anbragte membraner. (d) høj forstørrelse af membranhvirvler af (c). (e) Membranhvirvler (mv), der optager en stor del af kernen. (f) høj forstørrelse af dobbeltmembraner med septumkomplekser (pil) og tynde membraner (pilehoved). A: akrosom; N: kerne.

sædmodning fører til nuklear reorganisering og reduktion af dens størrelse. Fra litteraturen er det kendt, at nuklear modning involverer reduktion af nuklear kuvert, en dynamisk dobbeltmembran, der omgiver kernen, adskiller kromosomer og regulerer nuklear transport gennem porer . Mange detaljer om dens transformation er stadig uklare. Vores mikrografer af membranhvirvler viste kontinuitet af membraner med den nukleare konvolut (figur 5(A) og 5(c)). Membranstrukturer med septatelektron tætte molekylære komplekser produceres sandsynligvis under omorganiseringen af den nukleare kuvert. Disse strukturer blev beskrevet af flere forfattere som redundant nuclear envelope (RNE) . RNE ses i vores mikrograf af normale sædceller(figur 3 (d)).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

figur 5

tværsnit af sædceller i normosospermiske prøver ((A), (b) og (c)) med store nukleare fordybninger med membranhvirvler (mv). Acrosom membran er forbundet med nuklear kuvert (pile). C) Membranhvirvler med yderligere membraner mellem kerne og akrosom (pilespids). (D) stor del af ikke-kondenseret kromatin med granulær dannelse inde i kernen (pil) af sædceller med unormal morfologi. A: acrosom, N: nucleus og C: cytoplasma.

forskellige stadier af kromatinkondensation ses i vores mikrografer i alle prøver. I figur 5 (d) kan vi se en sædcelle med unormal morfologi i en proces med kromatinkondensation, som stadig er omgivet af stor mængde cytoplasma. Ved sen spermatogenese bliver sæd-DNA tæt pakket, fordi histoner erstattes af protaminer . Imidlertid forekommer kondensationsfejl ofte og resulterer i uregelmæssigt formede klare rum i forskellige størrelser i kernen . Kromatinkondensationssvigt vides at være forbundet med tilstedeværelsen af små og store vakuoler . Vores mikrografer afslørede mindre elektron lucent områder af ikke-kondenserede kromatin og nukleare vakuoler, som varierer i størrelse og altid indeholder amorft materiale eller/og membranhvirvler. De kan være mere udtrykt i sædceller af teratosospermiske prøver, og det kan være relateret til unormal sædmodningsproces og sædhovedvakuoler. Der kræves dog mere fokuseret forskning.

Acrosome blev fuldt udviklet i de fleste sædceller med sædhovedvakuoler. I nogle celler blev der observeret sammenkoblinger af indre akrosomale membran og nuklear kuvert (figur 5(A) og 5(b)). Akrosommorfogenese er en dynamisk proces, der involverer en tæt interaktion mellem Golgi-kompleks og nuklear kuvert af tidlig spermatid. Det har vist sig, at perinuclear theca (PT) er en cytoskeletal struktur, der dækker sædkernen hos pattedyr og har vist sig at spille en vigtig rolle i normal akrosomdannelse .

som gennemgået af Setti et al. , rapporterer nogle forfattere, at sædvakuoler er af akrosomal oprindelse og afspejler ikke-reageret akrosom . En negativ sammenhæng mellem tilstedeværelsen af vakuoler og sædkapaciteten til at gennemgå den akrosomale reaktion udsættes. Vores data viser, at sædhovedvakuolerne er unikke strukturer, normalt dækket af intakt akrosom.

unormale sædceller var til stede i begge typer sædprøver—normale og unormale. Abnormiteter påvirkede forskellige komponenter i sædcellerne, nemlig kromatin, akrosom, nakkeområde, mitokondrier og hale. Vi præsenterer flere mikrografer af unormale sædceller fra normosospermiske prøver med mindre kondenseret kromatin, bøjet hals, atypisk akrosom og unormal hovedform (figur 6).

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

figur 6

(A), b), c) og d) sædceller fra normale sædprøver med unormal morfologi. Kromatin er granulært og mindre kondenseret med mange klare pletter (hvide pile). Acrosom er unormalt dannet (a), delvist dannet (d) og undertiden forbundet med membranhvirvler (b). (c) bøjet halsområde. A: akrosom; N: kerne.

3.2.2. Funktion af Sædhovedvakuoler

på nuværende tidspunkt er det umuligt at angive, hvad den reelle funktion af sædhovedvakuoler er. Baseret på vores mikrografer af sæd ultrastruktur foreslår vi, at sædhovedvakuoler kan fjerne noget stof af ukendt oprindelse fra kromatin. Fordi de angiver den potentielle relation til både sædmodningsprocessen i den ene side og unormal kromatinkondensation i den anden, kan man spekulere i, at sædhovedvakuolerne kan være involveret i fjernelse af histoner, når de erstattes af protaminer. Men det er for tidligt for enhver konklusion, og yderligere forskning er nødvendig.

4. Konklusioner

resultaterne af denne undersøgelse indikerer, at sædprøver af mænd med teratosospermi er kendetegnet ved øget forhold mellem sædhovedvakuoler, selvom de også er til stede i sædprøver af normospermiske mænd. Dette indikerer, at de kan være relateret til patologisk tilstand. Vores mikrografer på sæd ultrastruktur indikerer, at sædhovedvakuoler er sammensat af membranhvirvler. Variationer i kromatinkondensation blev for det meste observeret i unormale sædprøver, og det er ikke udelukket, at de er relateret til den unormale modning og sædhovedvakuoler. Yderligere forskning, der kombinerer forskellige metoder og transmissionselektronmikroskopi, er nødvendig for bedre at belyse dette fænomen.

interessekonflikt

forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt med hensyn til offentliggørelsen af dette papir.

anerkendelser

forfatterne vil gerne takke de kliniske embryologer fra IVF Lab Ljubljana, Institut for Obstetrik og gynækologi, University Medical Center Ljubljana, for at forberede sæd og laboratorium til elektronmikroskopi af Institut for biologi, bioteknisk Fakultet, University of Ljubljana.